随着工业的高度发展，环境污染日益加重。工业废弃物中的硫化物会严重污染水体和空气，越来越受到人们的关注[1-3]。传统的脱硫方法运行费用高､二次污染较重，迫使技术人员寻求低能耗､高效率和无污染的脱硫方式[4]。生物脱硫是一项生物和环境领域的交叉学科技术，其优点是设备要求较低､操作条件温和(无需高温､高压和添加催化剂等)且无二次污染，被认为是一种绿色脱硫技术，具有很好的应用潜力[5-7]。
然而目前国内外无色硫细菌脱硫仍处于初始研究阶段，脱硫效果不理想，工业化程度不高[6，8]。其主要原因可归纳为脱硫反应器运行效果不理想缺乏以及该类脱硫微生物较为特殊的生理生化特性使得在脱硫过程的受到限制性因素影响较大[9，10]。大部分的工业废水成分复杂，常含高浓度的有机污染物和重金属离子，在一定程度上抑制化能自养型的脱硫微生物的生理活性，降低脱硫效率[11]。因此，探索该类微生物对不同有机物和重金属离子的耐受特性也非常重要。此外，研究表明，菌种的保藏不当和频繁的传代容易使微生物的活性降低，出现退化现象，造成不必要的经济损失[12]。因此，寻求高效简易的菌种保藏方法也很有必要。
本实验采用筛选于发电厂污水池的典型脱硫菌株HalothiobacillusneapolitanusCYJN-1(H.neapolita-nusCYJN-1)脱除硫代硫酸盐过程为研究对象，分别考察在气升式反应器的脱硫效果和动力学､对不同有机物和重金属离子的耐受性以及最佳保藏方法，为生物脱硫提供一定的理论基础。
1 实验材料和方法
1.1 实验菌种及来源
本研究所采用菌种为Halothiobacillusneapolita-nusCYJN-1，实验室保藏[13]。
1.2 培养基
富集培养基:Na2S2O3·5H2O10.0g，K2HPO44.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4· 7H2O0.8g，NH4Cl0.4g，微量元素10mL，蒸馏水1000mL。调节初始pH至7.0。
微量元素溶液成分:Na2EDTA50g，ZnSO4·7H2O22.0g，CaCl25.54g，MnCl2· 4H2O5.06g，FeSO4·7H2O4.99g，(NH4)6MO7O24· 4H2O 1.10g，CuSO45H2O1.57g，CoCl2·6H2O1.61g，蒸馏水1000mL。
1.3 内循环气升式反应器
本实验采用内循环气升式生物脱硫反应器，有机玻璃材质，反应器总容积约700mL，工作容积为500mL，其外径和高度分别为5cm和30cm。气体是由空气泵产生，通过导流筒将反应器内气-液-固相接触并充分混合，更好地实现培养体系的鼓泡混匀和氧传质。该反应器结构简单､供气效率高，利于单质硫的生成和分离。
1.4 实验方法
1.4.1 H.neapolitanusCYJN-1脱硫性能分析
选用较为稳定的还原态硫源———Na2S2O23为唯一能源底物，脱硫体系为水相的培养基。在30℃､通气量为360mL/min条件下培养56h，定期检测pH､S2O2-3 浓度､单质硫产量和生物量。
1.4.2 CYJN-1对有机物和金属离子耐受性研究
分别向培养基添加1%和3%的不同有机物(醇类-甲醇､乙醇､丙三醇和异丁醇;酸类-甲酸､乙酸､乳酸和正丁酸)，最适条件下培养40h，测定生物量和S2O2-3 含量。
1.4.3 CYJN-1有机物和金属离子耐受性研究
分别向培养基中添加0.1g/L和0.5g/L浓度的Cu2+､Zn2+､Mn2+､Cd2+､Pb2+､Cr2+和Ni2+等重金属离子，最适条件下培养40h，测定生物量和S2O2-3 含量。
1.4.4 菌种保藏实验
低温保藏方法优选:将菌种培养至对数生长期，2000r/min离心2min除去沉淀，8000r/min离心10min将菌液浓缩至107cells/mL作为保藏液。分别按以下方法在不同温度下(4℃､-20℃ 及-40℃)保藏。浓缩后的菌液;采用新鲜培养基悬浮浓缩后菌液;采用无菌水直接悬浮浓缩后的菌液;采用15%的甘油悬浮浓缩后菌液。将所保藏的菌液隔1个月后接种于新鲜培养基中，测定其存活率。
考察5种保藏方法中短期保藏过程对细胞存活率影响。反复培养保藏:将菌种培养至对数生长期，转接至新鲜培养基继续培养。低温保藏:如新鲜培养基悬浮保藏所述，每隔3个月重新培养保藏。平板保藏:将菌种接种于固体平板上培养4d，将含平板封口置于4℃保藏。甘油保藏:将灭菌的终浓度为15% 的甘油加至对数生长期的菌液中，置于-40℃下冷冻保藏。冷冻干燥保藏:将对数生长期的菌液浓缩100倍，放置离心管中迅速抽真空冷冻于-40℃下保藏。
1.5 分析方法
1.5.1 菌种生物量(CFU)测定
采用平板活菌计数法测定。将对数期的菌液离心去除大颗粒沉淀，8000r/min离心5min浓缩菌体。测定600nm吸光值，根据吸光度与CFU之间标准曲线计算菌落数量。
1.5.2 硫代硫酸钠浓度的测定
采用碘量滴定法测定[14]，步骤如下:配制稀释溶液:取1mL的培养液用水稀释至50mL(稀释50倍)。在碘量瓶中放入50mL的溶液，分别加入2mL17.5mol/L醋酸和1mL1% 的淀粉溶液。用0.01mol/L浓度的碘液滴定至出现不消失的蓝色为止，滴定所消耗的碘量来计算S2O2-3 的含量。计算公式如下:
式中:Y为所含S2O2-3 的量，mg/L;C是滴定的碘液浓度，为0.01mol/L;M 是S2O2-3 的分子量为11250是所加溶液的体积，为50mL;X是稀释倍数;VV0为滴定是所消耗的碘液体积。
1.5.3 单质硫的测定
单质硫的检测采用硫平衡法，公式如下:
式中:△CS2O23-为硫代硫酸盐浓度的减少量;△CSO24-为硫酸盐浓度的增加量，反应式如下:S2O2-3 +0.5O2 =S0 +SO2-4 ，S0 +2O2 =SO2-4 。单质硫检测和定量测定:高效液相色谱法(HPLC)结合元素守恒定律[15]。具体参见污水技术资料更多相关技术文档。
1.5.4 比生长速率和比消耗速率分析
菌种比生长速率(μx)和底物比消耗速率(μs)计算如以下方程式:μx为比生长速率(h-1)，μs为比消耗速率(×10-3 g/(cells·h))，X0 和S0 为初始时生物量(cells/mL)和底物浓度(g/L);Xt和St为测样时生物量(cells/mL)和底物浓度(g/L)。
