随着人们环境保护意识的提高，污水排放标准也在不断完善。活性污泥微生物在污水处理过程中净化水体，消除污染物等方面作用突出，因此通过研究活性污泥微生物的区系组成及群落结构的演替，找到运行时的优势菌种已成为水处理研究领域的热点[1]。而有机物-污泥负荷(Ns)在微生物生长动力学及活性污泥动力学的研究中具有重要意义。Ns反映了活性污泥污水处理过程的能量水平，直接影响了微生物的生长模式[2]。当Ns发生变化时，在短时间内微生物群落结构及污水处理效果都会发生明显变化[3]。因此有Ns作为活性污泥处理系统设计､运行最基本的参数之一，具有很高的工程应用价值[4]。
PCR-DGGE技术可直接从样品中提取细菌的DNA或RNA来表征微生物种群，克服了传统微生物群落结构分析方法的不足[5，6]，并且能够检测识别出不可培养的细菌，对细菌生态学的发展起到了巨大的推动作用[7]，已经成为对微生物群落结构进行多样性分析的主要生物学方法[8]。根据实验所测得的不同污泥负荷冲击条件下微生物群落结构和优势菌种来调节工艺运行参数，这对优化活性污泥系统运行､提高污水处理效果等都具有十分重要的实际应用价值和理论探索意义。
为了进一步研究Ns对活性污泥微生物的影响。实验以碳源作为限制条件，以某高校MBR内的污泥作为种泥，以SBR作为小试处理工艺，以某高校游泳馆污水为处理对象，综合运用PCR-DGGE技术，试讨论在不同Ns条件下活性污泥中氨氧化菌群落结构的演替及其多样性的变化情况，以期进一步了解Ns与活性污泥微生物群落结构和生物多样性的内在联系。
1 材料与方法
1：1 实验装置与运行条件
实验采用自行设计如图1所示的间歇进水序批式反应器(SBR)，反应器的主体以有机玻璃制成，长112mm､宽106 mm､高500 mm，设计水面高度400mm，其有效容积为4L。反应器中间采用有机玻璃隔板，隔板的上端距水面为约为50mm，下端为高度40mm左右的过水通道。采用隔板将反应器主体分割成体积比为6∶4的曝气区和非曝气区。非曝气区通过设置可控温度加热器维持水温恒定。在曝气区内采用微孔曝气，为微生物生长提供所需的溶解氧，同时达到泥水混合的效果。
实验以某高校MBR反应池内活性污泥作为接种污泥，培养驯化25d使其恢复活性并具有良好的沉降性。
实验用水为某高校游泳馆的污水和投加的葡萄糖。通过投加葡萄糖来调整进水有机物浓度以达到预期的实验要求。通过反应器的进水有机物浓度与曝气､沉淀､排水的时间来对污泥负荷进行调整。污泥负荷冲击采用超负荷法[9]，即对每一负荷阶段，当反应器系统运行稳定并取样分析之后，提高污泥负荷进行下一次冲击。传统活性污泥法系统设计的典型Ns为0：2~0：5kgBOD5/(kgMLSS·d);具有脱氮功能时一般选择较低的Ns为0：05~0：15kgBOD5/(kgMLSS·d);延时曝气氧化沟处理系统的Ns更低为0：03~0：08kgBOD5/(kgMLSS·d)，高负荷活性污泥法Ns为1：5~3kgBOD5/(kgMLSS·d)[10]，因此本实验将污泥负荷阶段分为三大阶段，共7个污泥负荷冲击过程进行，各冲击负荷阶段的运行参数见表1。污泥负荷冲击2d后立刻取样，用于后续PCR-DGGE分析。
1：2 污泥样品基因组DNA的提取与纯化
1：2：1 样品预处理
将8mL污泥混合液加入至10mL灭菌离心管中，在3000×g下离心4min，弃去上清液。用灭菌蒸馏水清洗一次，同样的条件下离心4min，弃去上清液。得到的污泥样品可用于DNA的提取。
1：2：2 基因组DNA的提取
基因组DNA的提取采用化学裂解-酚氯仿异戊醇抽提-试剂盒纯化的方法，具体步骤见参考文献[9]。
1：3 氨氧化菌的NestedPCR扩增
氨氧化菌的NestedPCR扩增技术需经过2轮的PCR扩增，第1轮以总DNA为模板使用氨氧化菌的特定目标引物和相应的PCR反应程序对氨氧化菌进行针对性扩增;第2轮以第1轮PCR扩增产物为模板用通用引物F357-GC和R518与PCR反应程序进行扩增。氨氧化菌的特异性引物对为上游引物是将CTO189fA/B与CTO189fC以2∶1的摩尔比混合，下游引物为CTO654r[11]。第1轮PCR反应体系为25μL的2×TaqPCRMasterMix，1μL的上游引物，1μL的下游引物，1μL的模板，然后用无菌超纯水补足至50μL。第1轮PCR反应体系同上，同时做空白对照。
扩增后PCR产物经琼脂糖电泳检测片段大小约为250bp，表明PCR扩增成功，可进行后续DGGE电泳分析。
1：4 氨氧化菌16SrDNA片段的DGGE分析
实验采用C：B：S： SCIENTIFIC 公司DGGE-2001系统对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分离，完毕后将凝胶进行硝酸银染色，碳酸钠显影，并将图像在观测仪中进行拍照存档。
1：5 目的条带的克隆与测序
选取DGGE上明显的条带用灭菌刀切取并置于1：5mL的灭菌离心管中，加入50μL已灭菌的超纯水，在60~100℃下水浴20min;取出离心管置于4℃冰箱中静置过夜，待DNA片段从胶中缓慢浸出。将离心管在5000r/min下离心5min，取6μL浸出液为模板进行PCR扩增。
将PCR扩增产物置于1：5% 琼脂糖凝胶中检测，若电泳结果较好，则将PCR产物送至天津华大基因技术有限公司进行DNA常规测序。
1：6 DGGE图谱的生物多样性及相似性分析
通过应用Bio-Rad公司的凝胶分析软件Quanti-tyOne(4：26版)对扫描所得DGGE图谱中氨氧化菌条带的强度进行分析，将每个条带的强度转化为峰面积值输出，并采用Shannon-Wiener多样性指数计算公式进行计算。对微生物群落内微生物菌种的多样性进行评价。利用戴斯系数(Cs)讨论氨氧化菌群的相似性。同时根据DGGE条带分布的相似程度构建标准泳道比较图和族群归属系统树状图。具体参见污水技术资料更多相关技术文档。
多样性指数H计算公式为:
式中:Pi=ni/N，其中ni为条带i的峰面积，N为所有峰的总面积。
戴斯系数计算公式为:
式中:j为泳道A和B共有条带，a和b分别为样品A和B中各自的条带数。