1 引言
金属硫化物矿山是我国重要的金属矿山类型之一.在采、选、冶矿过程中，区域内地下水或地表水与矿石中金属硫化物接触，通过微生物对金属硫化物的氧化作用而逐渐转变为酸度强、Fe2+、Fe3+与SO2-4含量高，以及含一定量重金属离子(As、Ni、Cd、Cr等)的酸性矿山废水.酸性矿山废水的排放严重污染了矿区周边和下游水土环境，其所含的重金属等污染物亦会通过土壤-植物系统进入食物链，进而威胁人体健康.
氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans)对Fe2+生物氧化与石灰中和相耦合是一种具有发展潜力的酸性矿山废水处理工艺.该工艺的Fe2+生物氧化阶段不仅可以克服酸性矿山废水中Fe2+难于自然氧化这一瓶颈，促进体系Fe离子在后续石灰中和过程中高效沉淀;而且Fe2+生物氧化阶段产生的次生铁矿物(黄铁矾等)能够对酸性矿山废水体系中重(类)金属离子产生吸附与共沉淀作用，进而降低酸性矿山废水处理后排水中的重(类)金属含量.鉴于此，提高体系Fe2+生物氧化速率及黄钾铁矾等次生铁矿物合成效率(或总Fe沉淀效率)是利用该工艺处理酸性矿山废水的关键所在.然而，不同季节温度条件下，酸性矿山废水处理工程运行中Fe2+生物氧化阶段速率相差较大，尤其是在冬季低温条件下，由于A. ferrooxidan 活性降低，体系Fe2+生物氧化缓慢.前人研究表明，体系Fe2+生物氧化和总Fe沉淀与A. ferrooxidans密度存在显著正相关关系，即体系A. ferrooxidans密度越大，Fe2+生物氧化速率越快，总Fe沉淀效率越高.另外，Wang等研究证实，Fe2+的生物合成黄铁矾体系中，合成的黄铁矾表面会吸附有一定量的A. ferrooxidans菌体，且吸附于黄铁矾矿物表面的A. ferrooxidans菌体对溶液中Fe2+有较强的生物氧化能力.同时，王敏等证实，初期引入的黄铁矾亦可以作为“晶种”促进后续黄铁矾的生物合成，提高体系总Fe沉淀效率.若将酸性矿山废水处理过程中Fe2+生物氧化阶段吸附有A. ferrooxidans菌体的黄铁矾重新回流进入酸性矿山废水体系，对提高不同温度体系，尤其是低温体系中Fe2+生物氧化效率与总Fe沉淀效率具有一定的应用潜力.然而，目前尚有部分科学问题尚未阐明.例如，吸附有A. ferrooxidans菌体的黄铁矾在不同温度下对体系Fe2+生物氧化速率与总Fe沉淀效率促进效果如何?不同温度下所得到的黄铁矾晶体形貌是否存在差异?形貌的改变是否会进一步影响黄铁矾矿物的比表面积?此类相关问题的阐明可有效揭示黄铁矾等矿物回流对酸性矿山废水处理工程运行的实际意义，且利于指导不同季节温度条件下工程运行中矿物回流量等相关参数的选择.此外，不同体系所得黄铁矾晶体形貌及比表面积差异亦能为酸性矿山废水体系重(类)金属去除行为提供必要的理论及参数支持.
鉴于此，本研究拟通过摇瓶实验，在pH 约2.50的K2SO4(8 mmol · L-1)-FeSO4(160 mmol · L-1)-H2O富铁酸性硫酸盐体系(模拟酸性矿山废水体系)中，在15 ℃和30 ℃两个温度水平下，探究附着A. ferrooxidans菌体的黄钾铁矾回流对体系Fe2+生物氧化与总Fe沉淀行为的影响，分析不同温度体系所得到的黄钾铁矾的形貌及其比表面积，以期为酸性矿山废水工程治理提供一定的参数支撑.
2 材料与方法
本研究所用化学药品与试剂级别均为分析纯级.试验所需溶液均为用去离子水配制的新鲜溶液.所用三角玻璃瓶经过10% HNO3浸泡后，用去离子水清洗数次，55 ℃烘干备用.
2.1 氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans LX5)来源与培养基
菌株来源：本研究所用到的氧化亚铁硫杆菌菌株(A. ferrooxidans LX5，CGMCC No.0727)由南京农业大学固体废物研究所提供，由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏.
培养基：本试验A. ferrooxidans LX5驯化与培养所用到的培养基为改进型9K液体培养基(谢越等，2012;Liu et al., 2015).各无机盐浓度(g · L-1)为：FeSO4 · 7H2O 44.2，K2HPO4 0.058，(NH4)2SO4 3.5，Ca(NO3)2 · 4H2O 0.0168，KCl 0.119，MgSO4 · 7H2O 0.583，用9 mol · L-1H2SO4调节pH至约2.50，4 ℃保藏备用.
2.2 氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans LX5)接种液与附着微生物黄铁矾的制备
在250 mL锥形瓶中，将A. ferrooxidans LX5菌株接种于150 mL改进型9K液体培养基中，之后将体系置于30 ℃恒温振荡器(ZD-85A型)中在180 r · min-1条件下振荡培养，至微生物指数生长阶段后期(体系Fe2+完全氧化，周期约2~3 d)停止培养并过滤.将过滤后的A. ferrooxidans LX5菌液15 mL再次接种于135 mL改进型9K液体培养基中，重复上述培养过程，如此循环3批.最后1批培养完成(第2批、第3批体系Fe2+在36 h即可完全氧化)过滤后得到的滤液为本试验研究过程中所用的A. ferrooxidans LX5接种液，A. ferrooxidans LX5密度约为107 cells · mL-1，4 ℃保藏备用.
将15 mL A. ferrooxidans LX5接种液接种于135 mL pH约2.50的K2SO4(8 mmol · L-1)-FeSO4(160 mmol · L-1)-H2O体系，在30 ℃、180 r · min-1环境下培养至体系Fe2+完全氧化，后将培养液真空(P=-0.082 MPa)抽滤至无水滴出为止，得到的赭黄色沉淀即为本试验所用的30 ℃环境中获得的吸附有微生物的黄铁矾(记为“MJ30”)，经测定，抽滤后该黄铁矾水分含量为11.4%.相类似，将上述体系在15 ℃、180 r · min-1环境下培养，得到的赭黄色沉淀为本试验所用的15 ℃环境中收获的吸附有微生物的黄铁矾(记为“MJ15”)，经测定，抽滤后该黄铁矾水分含量为14.9%.
2.3 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系Fe2+氧化及总Fe沉淀的影响
在系列250 mL三角瓶中分别加入4 mL A. ferrooxidans LX5接种液，然后按如下方式设置4个处理：①处理1：在上述体系加入富铁硫酸盐溶液146 mL，其中，K2SO4与FeSO4摩尔浓度分别为8 mmol · L-1与160 mmol · L-1，用6 mol · L-1 H2SO4与6 mol · L-1 NaOH调节体系pH至约2.50，体系A. ferrooxidans LX5密度约为3×105 cells · mL-1，在30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(处理记为“CK30”);②处理2：在处理1的基础上补充1.5 g MJ30，与处理1同条件下培养(处理记为“CK30+10 g · L-1 MJ30”);③处理3：体系无机盐离子浓度与微生物接种量同处理1，15 ℃、180 r · min-1条件下培养(处理记为“CK15”);④处理4：在处理3的基础上补充1.5 g MJ15(处理记为“CK15+10 g · L-1 MJ15”)，与处理3同条件下培养.所有处理均设置3个重复.在培养过程中，每隔12 h定期监测各处理体系pH变化过程，且从体系均匀取样1 mL，过0.22 μm滤膜，测定溶液中Fe2+与总Fe浓度，进而推算体系Fe2+氧化效率与总Fe沉淀效率.各处理体系Fe2+氧化完全时，对其培养液进行真空抽滤，收获矿物.分析矿物矿相、形貌及比表面积等相关参数.
2.4 测定方法
溶液pH使用数显式酸度计(pHS-3C，上海)进行测定.邻菲罗啉比色法测定溶液中Fe2+、总Fe离子浓度.根据反应至t时刻与培养初期(0 h)溶液中Fe2+、总Fe离子浓度差异，计算体系t时刻Fe2+氧化效率与总Fe沉淀效率.矿物矿相通过X射线衍射仪扫描矿物特征衍射峰，出峰位置和强度与粉末衍射标准联合委员会提供的JCPDS标准卡片相匹配，分析矿物矿相.利用热场发射扫描电子显微镜(SEM，JSM-7001F)观察矿物形貌.矿物的比表面积采用全自动比表面与空隙分析仪进行测定.
2.5 统计方法
使用Microsoft Excel 2003软件对本研究所得数据进行统计分析，计算各组数据平均值及其标准偏差.使用Origin 7.5软件对数据点进行制图，并以平均值与标准偏差(误差线)形式表示.
3 结果与讨论
3.1 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系Fe2+氧化过程pH变化的影响
酸性硫酸盐体系Fe2+氧化过程中pH变化能够间接表征体系Fe2+氧化(耗H+行为)及Fe3+水解成矿(次生铁矿物黄钾铁矾合成，产H+行为)发生过程.本研究中，附着微生物黄铁矾回流对酸性硫酸盐体系Fe2+生物氧化过程中pH变化的影响如图 1所示.
图1 附着微生物黄铁矾回流对富铁酸性硫酸盐体系Fe2+生物氧化过程中pH变化的影响
从图 1a可以看出，15 ℃对照处理(CK15)体系在0~48 h培养过程中，体系pH逐渐从初始时刻的2.50升高至2.81，之后缓慢降低至144 h时的2.40.附着微生物黄铁矾的回流可在一定程度上促进体系pH降低.具体表现为，CK15+10 g · L-1 MJ15处理体系在0~24 h培养过程中，pH从初始时刻的2.50增加至2.74，之后逐渐降低至反应终态的2.24.前已提及，体系Fe2+氧化及Fe3+水解成矿过程分别调控着pH升高与降低幅度.可见，与对照相比较，附着微生物黄铁矾的回流促进了体系Fe3+水解成矿的快速启动.与15 ℃培养环境相比较，30 ℃环境中由于各反应阶段Fe3+水解成矿作用要强于Fe2+氧化作用，各处理体系中pH未表现出升高的变化趋势，而是呈现出近似线性的pH降低过程(图 1b).30 ℃对照处理(CK30)体系pH与反应时间的变化关系为pH=2.54-0.0087t(R2=0.984).然而，当在30 ℃对照处理体系回流10 g · L-1附着微生物黄铁矾时，体系pH在60 h时降低至1.85，pH与时间的变化关系为pH=2.50-0.0111t(R2=0.998).比较两拟合直线斜率可知，在30 ℃培养环境中，10 g · L-1附着微生物黄铁矾回流可使得体系pH降低速率提高27.6%.同时从图 1a与图 1b亦可以获知，温度的升高可大幅度降低体系pH.就不同温度下对照体系而言，CK30对照体系在72 h时pH降低至1.89，而CK15对照体系在同一时刻pH却为2.77.这一研究结果与他人研究结果相一致，宋永伟等(2013)研究发现，在pH=2~3，Fe2+为160 mmol · L-1(与本研究相同)，温度为10 ℃的酸性富铁硫酸盐培养体系，Fe3+水解成矿导致pH降低的过程十分微弱，而当温度增加至28 ℃时，体系pH降低速率显著.然而，需要指出的是，本研究15 ℃培养环境体系pH下降速率要显著快于宋永伟等(2013)在10 ℃环境中培养A. ferrooxidans LX5得到的pH降低速率，虽然两者体系温度仅有5 ℃之差.
3.2 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系Fe2+氧化率的影响
氧化亚铁硫杆菌A. ferrooxidans LX5是一种化能自养型微生物，其可以通过氧化Fe2+获得生命活动所需要的能量来维持生长.故该体系Fe2+氧化速率可以间接表征体系A. ferrooxidans LX5生长情况及其活性.本试验附着微生物黄铁矾回流对酸性硫酸盐体系Fe2+氧化率的影响见图 2.
从图 2可以得出，15 ℃对照处理(CK15)体系在0~144 h培养过程中，体系Fe2+氧化率呈现近似指数模型的增长趋势.该体系微生物适应环境的停滞期较长(0~60 h)，在0~60 h培养过程中，Fe2+氧化率不足10%，在144 h时达到46.7%.若在该体系回流附着微生物黄铁矾，体系微生物停滞期明显缩短，Fe2+氧化速率被有效促进.具体表现在，CK15+10 g · L-1 MJ15处理体系在132 h时体系Fe2+氧化完全，且Fe2+氧化率随时间呈现近似线性的增加关系，拟合直线可表示为Fe2+氧化率E=0.7817t-2.64(R2=0.997).可见，附着微生物黄铁矾回流可快速启动低温环境中Fe2+的生物氧化进程.笔者认为，这与附着微生物黄铁矾回流可在一定程度上增加体系A. ferrooxidans LX5浓度有一定关系.王雅琴等(2010)研究表明，体系氧化亚铁硫杆菌接种量较低时，Fe2+氧化呈近似指数缓慢增长模式，而增加氧化亚铁硫杆菌接种密度，Fe2+氧化呈近似线性增加趋势，与本研究结果相一致.30 ℃培养环境中，CK30对照体系与CK30+10 g · L-1 MJ30处理体系Fe2+完全氧化之前，Fe2+氧化率均随时间呈现显著线性关系.通过比较两体系Fe2+氧化率随时间线性拟合的斜率(图 2b)，可以得出，30 ℃培养环境中10 g · L-1附着微生物黄铁矾回流能够使得体系Fe2+氧化速率提高20.0%.综上所述，温度升高可促进富铁酸性硫酸盐废水体系A. ferrooxidans LX5对Fe2+的生物氧化.例如，CK30对照体系培养过程中微生物适应环境所需停滞期几乎可以忽略，体系Fe2+氧化率在72 h即可达到100%，而在CK15对照体系，该时刻的体系Fe2+氧化率仅为9.7%.同时，附着微生物黄铁矾回流能促进不同温度体系Fe2+的生物氧化过程，尤其是冬季低温条件下进行酸性矿山废水处理，附着微生物黄铁矾回流显得尤为必要.
图2 附着微生物黄铁矾回流对富铁酸性硫酸盐体系Fe2+生物氧化率的影响
3.3 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系Fe2+氧化过程中总Fe沉淀行为的影响
富铁酸性硫酸盐环境中Fe2+氧化过程常伴随次生铁矿物的产生，其在合成过程中可吸附或共沉淀酸性矿山废水中重金属离子，Fe元素是构成次生铁矿物的关键元素.同时，该环节总Fe大量沉淀，将会缓解后续石灰中和过程总Fe的去除负荷.因此，综合考虑重金属去除效果与后续体系Fe离子中和去除成本，总Fe沉淀率是该环节需要考虑的关键运行参数之一.本试验中附着微生物黄铁矾回流对酸性硫酸盐体系Fe2+氧化过程中总Fe沉淀率的影响如图 3所示.
图3 附着微生物黄铁矾回流对富铁酸性硫酸盐体系Fe2+生物氧化过程中总Fe沉淀率的影响
从图 3可以看出，CK15对照处理体系前60 h培养过程中无Fe离子沉淀现象发生，96 h后，体系总Fe沉淀现象明显，在培养过程结束时刻(144 h)，体系总Fe沉淀率达到12.2%.CK15+10 g · L-1 MJ15处理体系在0~24 h培养过程中几乎无Fe离子发生沉淀，在24~132 h 培养过程中，总Fe沉淀随培养时间呈近似指数增加趋势.在132 h(Fe2+完全氧化)，总Fe沉淀率达到24.1%.在132~144 h培养过程中，体系中总Fe沉淀率小幅增加至25.3%.换言之，在15 ℃酸性富铁硫酸盐体系接入A. ferrooxidans LX5培养144 h后，10 g · L-1附着微生物黄铁矾的回流可使得体系总Fe沉淀率提高97.5%.30 ℃培养环境中，CK30对照体系总Fe沉淀率在72 h(Fe2+完全氧化)时为34.3%，CK30+10 g · L-1 MJ30处理体系总Fe沉淀率在60 h(Fe2+完全氧化)时即可达37.3%.从图 2b与图 3b可以得出，在30 ℃培养环境中，Fe2+氧化率随时间的变化趋势近似线性，而总Fe沉淀率随时间符合指数模式的增长模型.笔者认为，总Fe沉淀率随时间的变化趋势与体系Fe2+氧化速率(及Fe3+供应速率)有一定相关关系.柏双友等证实，酸性硫酸盐体系中Fe2+在24 h内氧化完全时，总Fe沉淀率与培养时间符合对数(前期快速-后期缓慢)增长模型.刘奋武等的研究结果表明，酸性硫酸盐体系Fe2+氧化在48 h内完成时，体系总Fe沉淀率随时间近似为线性增长模型.本研究体系，在30 ℃培养环境中，Fe2+在60~72 h氧化完全，体系总Fe沉淀率却随培养时间近似为指数(前期缓慢-后期快速)增长模型.综上所述，酸性硫酸盐体系Fe2+氧化过程中，随着Fe2+氧化越快，总Fe沉淀率随培养时间易呈现对数增长;相反，Fe2+氧化越慢，总Fe沉淀率随培养时间易呈现指数增长.本研究15 ℃培养体系中，总Fe沉淀率变化亦为这一结论提供了较好的佐证.综上所述，相对于30 ℃高温条件，低温条件(15 ℃)下，Fe2+氧化速率缓慢，总Fe沉淀率明显降低.附着微生物黄铁矾的回流可以通过提高体系微生物数量，引入“晶种”等作用，来显著提高不同温度体系Fe2+氧化效率与总Fe沉淀效率.并且，在低温环境下这一促进效果尤为明显.
3.4 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系合成次生铁矿物矿相的影响
X射线光谱分析(XRD)是区分晶型矿物与非晶型矿物，鉴别矿物最常用的手段之一.本研究中，不同处理体系所得次生铁矿物XRD衍射图谱如图 4所示.从图 4可以看出，各处理体系所得矿物的XRD衍射图谱几乎一致.通过Jade5.0软件的寻峰分析，并且将本研究矿物的XRD衍射图谱与JCPDS(2002)所提供黄钾铁矾(No.22-0827)卡片的标准衍射峰进行比对，可知本试验不同处理体系得到的次生铁矿物均为黄钾铁矾物质，且本研究所得矿物XRD衍射图谱与其它研究人员所得黄钾铁矾XRD衍射图谱相一致富铁酸性硫酸盐体系Fe2+生物氧化过程中，体系首先合成的次生铁矿物为无定型态的施氏矿物，之后施氏矿物转化为晶型结构明显的黄铁矾类物质.本研究不同处理体系所得矿物的XRD衍射图谱并未观察到明显的施氏矿物衍射峰.前人的研究结论为本试验结果提供了较好的佐证，例如，Bai等在28 ℃、Fe2+浓度为160 mmol · L-1条件下得出，在Fe2+浓度为160 mmol · L-1、Fe/K摩尔比为10的酸性硫酸盐体系中，15 ℃条件下合成的次生铁矿物仍然是单一的黄铁矾物质，而无施氏矿物产生.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
图4 不同处理体系所得矿物XRD衍射图谱
3.5 附着微生物黄铁矾回流对不同温度酸性硫酸盐体系合成次生铁矿物形貌的影响
扫描电子显微摄影技术(SEM)常用来观察矿物的形貌特征.本研究不同体系所得矿物扫描电镜照片及矿物比表面积见图 5.从图 5可以看出，CK15对照处理体系所得黄钾铁矾晶体表面光滑，粘附程度明显，比表面积为1.80 m2 · g-1.当体系中回流附着微生物的黄铁矾后，矿物形貌差别不大，比表面积也近似一致(1.85 m2 · g-1).CK30对照体系所得黄钾铁矾晶体棱角明显，且较为分散，比表面积为5.22 m2 · g-1，然而附着微生物的黄铁矾回流却使得矿物晶体变得光滑，晶体粘附度增加，比表面积为1.77 m2 · g-1，降低了66%.此外，对比不同温度下对照体系可知，CK30对照体系所得黄钾铁矾晶体比表面积为CK15对照处理体系所得矿物比表面积的2.9倍.笔者认为，不同体系Fe2+生物氧化速率与微生物分泌胞外多聚物差异可能是温度调控矿物形貌及其比表面积的内在原因，本课题组将在后续研究中予以关注.
图5 不同处理体系所得矿物SEM图片
4 结论
温度为15~30 ℃的富酸性硫酸盐体系中，附着微生物(A. ferrooxidans)黄铁矾回流可以显著提高体系Fe2+氧化率与总Fe沉淀率.在Fe2+浓度为160 mmol · L-1、Fe/K摩尔比为10的硫酸盐体系中，15~30 ℃温度范围合成的次生铁矿物均为单一的黄钾铁矾，无施氏矿物出现.附着微生物黄铁矾回流对15 ℃环境下黄铁矾矿物形貌影响不大，为表面光滑的黄铁矾晶体.然而，在30 ℃环境中，附着微生物黄铁矾回流可将体系原本棱角明显的晶体结构变得表面光滑，比表面积降低了66%.