1 引言(Introduction)
生物脱氮(Biological Nutrient Removal，BNR)是主流的和最具成本优势的脱氮技术，主要由自养硝化和异养反硝化两阶段组成.反硝化过程可以在缺氧和厌氧条件下进行，亚硝酸盐氮先被还原为硝酸盐氮，硝酸盐氮再被还原为气态氮，最终实现氮的去除，但氧可以取代亚硝酸盐和硝酸盐作为电子受体使反硝化过程失效.因为传统脱氮理论认为，氧作为电子受体是优先于亚硝酸盐和硝酸盐的，后者不再是末端电子受体，进而使反硝化过程被抑制.随着生物脱氮理论研究的进一步深入，20世纪80年代，Thiosphaera pantotropha作为第一种好氧反硝化菌在脱硫反硝化系统中被发现，并证明存在好氧反硝化酶系统.在这一研究成果的基础上，新的好氧反硝化菌不断被发现和分离出来.而好氧反硝化理论可以简述为，在好氧反硝化过程中，有机碳源为电子供体，氧、亚硝酸盐和硝酸盐均为电子受体，最终硝酸盐类被转化为气态氮;这一过程中起作用的酶为硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶.因此好氧反硝化的特点可以归纳为：①反硝化过程在好氧条件下进行可实现同步硝化反硝化;②硝化产物可以直接作为反硝化底物被利用以避免硝酸盐类物质的积累;③反硝化生成的OH-可以部分补充硝化作用消耗的碱度以维持pH的相对稳定.
近年来，对好氧反硝化的研究主要集中在特定好氧反硝化菌株的分离和其反硝化特性的研究，但特定菌株的反硝化特性与碳源类型、碳氮比、温度、溶解氧和pH等因素有关;而且不同氮源也影响菌株的反硝化特性.从可能的工程实际应用角度考虑，对好氧反硝化菌群整体和其反硝化特征应进一步研究是有必要的，本论文的研究目的即在于此.在先前的连续流A/O流离反应器同步硝化反硝化研究过程中发现，好氧反硝化过程在同步硝化反硝化中起到非常重要的作用，研究结果也证明了好氧反硝化菌的存在.因此有必要以整体菌群为研究对象，在特定水环境条件下对不同氮源对功能细菌的活性影响和反硝化特征进行研究，使好氧反硝化菌和好氧反硝化作用在污水治理中具有实际应用的可能性.
2 材料与方法
2.1 试验装置
图 1为采用流离生物技术的一套小型流离生物膜反应器.反应器为单格室，有效容积3.2 L，格室结构与文献19的A/O流离反应器单一格室类似，填料是取自A/O反应器好氧区内的流离球，流离球直径.反应器下部出水，上部进水，蠕动泵控制.采用底部曝气盘曝气，曝气量控制和计量采用微电脑曝气装置控制，通过探头精确测量和微调，实现试验所要求的富氧水环境条件.温度控制采用加热棒实现.
图1 小型流离生物膜反应器示意图
流离现象的解释：流体在流动中总存在着不同的流速快和流速慢的场所，固体物和有机物胶体在流体的流动中，总是由流速快的一侧向流速慢的一侧集中聚集，这种现象称之为“流离”.流离生化处理技术即是在无压力、只需水体稍微流动、填料为表面经过特殊处理的材料的集合体(流离球)中实现.污水在流动中存在着球体外流速快，球体内流速慢的状况，污水中漂浮物集中在流速慢的地方产生流离现象.经过无数次流离作用，使污水中的固体物和有机物胶体与水分离，再结合生化分解，构成了流离生化技术.试验用反应器即依照该原理构建、运行.
试验用水分别为低碳氮比废水(以氨氮为氮源的废水)、硝酸盐废水和亚硝酸盐废水.低碳氮比废水采用自来水投加醋酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾配制;硝酸盐和亚硝酸盐配水采用自来水投加氯化铵、硝酸钾、亚硝酸钠配制模拟高碳氮比废水，药剂投加量以满足试验要求的浓度范围为准.分类水质和控制温度如表 1所示.
表1 试验原水水质和温度条件
2.2 常规分析方法
水样测定前经0.45 μm滤纸过滤，NH4+-N、NO2--N、NO3--N依据标准方法检测(国家环境保护总局，2002)，TN和TC、TOC、TIC使用vario TOC设备(Elementar，德国)测定.DO、pH、温度采用在线探头监测(WTW，德国).
2.3 16S rDNA提取、PCR扩增、克隆测序及系统发育分析
DNA提取采用上海生工生产的试剂盒，PCR扩增所用引物如表 2所示.
表2 PCR扩增探针
反硝化菌使用引物nirS1F和nirS6R对反硝化菌进行扩增.PCR反应体系(50 μL)为：5 μL的10×PCR buffer，dNTP(各2.5 mmol · L-1)2 μL，nirS1F(20 μmol · L-1)1 μL，nirS6R(20 μmol · L-1)1 μL，Taq酶(5U)1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL.PCR采用降落式扩增程序，具体反应条件为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共进行20个循环，每个循环降低0.5 ℃;95 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共进行10个循环;72 ℃延伸10 min.
对PCR扩增产物进行切胶纯化，将PCR回收产物与pMD18-T载体进行连接后，转入JM109感受态细胞，最后进行蓝白斑筛选.挑取阳性克隆子，送往上海生工进行测序.将所得序列利用BLAST程序与GenBank中已登录的序列进行同源性比较，并利用MEGA4.0软件中的邻接算法构建系统发育树.
2.4 荧光原位杂交技术(FISH)
FISH技术用于分析活性细菌的相对数量以达到判断系统运行状况的目标.氨氧化菌采用NSO1225(CGCCATTGTATTACGTGTGA)探针、亚硝化菌采用NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)探针检测(Schmid et al., 2000).杂交步骤如下：
(1)污泥取样：流离填料经超声后将剥离的污泥取2～5 mL至离心管，2000 r · min-1离心5 min，去上清液(加蒸馏水重复两次);样品加入1 mL多聚甲醛并摇匀，4 ℃下放置3 h.样品12000 r · min-1离心5 min，去上清夜;加入1×PBS摇匀，10000 r · min-1离心5 min，去上清夜(重复3次);加0.5 mL的1×PBS、0.5 mL无水乙醇，摇匀后-20 ℃保存.
(2)样品固定：稀释样品3~5倍，对样品进行超声处理，将污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数.然后取3 μL样品涂于包埋明胶的玻片上(检查样片本底)，37 ℃的热烘箱固定2 h.依次用质量比50%、80%、98%的乙醇浸渍3 min，对细胞进行脱水并干燥.
(3)样品杂交：吸取2 mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46 ℃杂交炉中放置数min;吸取10 μL探针贮存液和80 μL杂交缓冲液(Hybridization Buffer，HB和Washing Buffer，WB)，混合后用箔纸包好放入46 ℃杂交炉中预热数min;探针贮存液浓度为25 ng · μL-1，用无菌水稀释购买的探针，吸取9 μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46 ℃下进行杂交2~3 h;杂交后打开恒温水浴槽，加热到48 ℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热.杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48 ℃水浴20 min后用4 ℃冰水冲洗样品，样品洁净台中挥干.
(4)封片观察：涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装;用带有360 nm激发波长、460 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞.
3 试验结果与讨论
3.1 低碳氮比废水好氧反硝化研究
3.1.1 反应器运行状态
图 2a所示为反应器内持续24 h的DO和pH变化趋势.由于好氧反硝化菌对DO浓度不敏感，维持较高DO浓度并不影响好氧反硝化菌的生长和活性.同时pH并未出现大的波动，在整个试验过程中始终维持在7.0~8.0之间，这一pH范围适宜硝化菌和反硝化菌的生存，偏碱性环境表明存在较好的反硝化作用.温度稳定控制在25~30 ℃.
图2 运行参数和物质浓度变化趋势
3.1.2 物质去除过程分析
低碳氮比废水可以看作以氨氮为主要氮源的废水.图 2b和2c分别为氮类物质和碳类物质去除及转化趋势.由图 2b可知，总氮和氨氮浓度沿反应时间逐渐下降，曲线斜率大于城市污水试验;亚硝酸盐和硝酸盐在反应进行10 h后出现少量积累，硝酸盐积累量小于亚硝酸盐.对应图 2c，有机碳浓度在0~10 h之间快速降低，而无机碳变化幅度相对很小.这一趋势表明，0~10 h内的氨氮去除可能来自异养硝化作用，好氧反硝化作用将硝化作用生成的硝酸盐类物质去除.原因如下：一是由于部分好氧反硝化菌也是异养硝化菌，在低碳氮比污水脱氮过程中，异养硝化菌与自养硝化菌竞争氮源，氨氮的去除主要由异养硝化菌完成，因此有机碳被大量消耗，而无机碳浓度下降趋势小于有机碳.二是可能同时存在亚硝酸盐还原酶和硝酸盐还原酶，硝化过程产生的硝酸盐类物质在高活性亚硝酸盐还原酶和硝酸盐还原酶作用下被迅速还原.试验中还发现，1~2 h的氨氮有突降，可能是存在某种自养硝化菌使少量氨氮在试验初期被直接转化为气态氮去除，但暂时缺乏试验支持，需进一步研究.总之，0~10 h反应器内出现了同步硝化反硝化现象，而且主要可能来自异养硝化-好氧反硝化作用.
在10~24 h阶段，图 2c显示有机碳下降趋势基本结束，但是无机碳浓度开始下降.对应图 2b所示，10~24 h氨氮浓度继续下降，硝酸盐和亚硝酸盐开始产生小幅度的积累.分析原因：一是由于有机碳被大量消耗后，异养硝化菌的增殖受到碳源不足的影响，活性降低;而自养硝化菌增殖速度加快，活性增强，对无机碳源的消耗增大，表明这一阶段的氨氮去除主要来自自养硝化作用.二是由于有机碳源的不足使好氧反硝化菌对硝酸盐类物质的去除能力也被削弱;但是由于自养硝化菌可以利用NH3氧化的能量还原CO2为有机碳供生命活动，一定程度上也补充了有机碳的消耗，好氧反硝化菌可以继续保持一定的反硝化作用，但反硝化程度受限，因此可能导致硝酸盐类物质的小幅积累现象.三是亚硝酸盐是硝酸盐反硝化过程的中间产物，其浓度过高易对硝酸盐还原为亚硝酸盐这一步骤产生抑制作用，从而降低硝酸盐的还原量，但亚硝酸盐浓度达到多少即影响硝酸盐的还原，目前暂时无数据支撑.而硝酸盐的少量积累，表明亚硝酸盐积累的浓度已经达到影响好氧反硝化菌对硝酸盐反硝化能力的程度.
在连续24 h的低碳氮比好氧反硝化研究中，反应阶段被分为异养硝化-好氧反硝化和自养硝化-好氧反硝化两阶段，但均符合同步硝化反硝化特征.根据计算可知，0~10 h的同步硝化反硝化率为79.40%，10~24 h的同步硝化反硝化率为81.25%.
3.1.3 荧光原位杂交试验
以上的好氧反硝化特征分析以及少量的硝酸盐类物质积累现象依旧存在一个问题，就是观察到的亚硝酸盐积累是否一定来自好氧反硝化能力被削弱才产生的，还是由自养硝化作用生成，这需要通过其它研究手段来判断.图 3为第23 h的氨氧化菌(AOB)和亚硝化菌(NOB)的相对数量对比，放大倍数为120倍.从绿色光电数量来看，二者活性菌数量基本接近，说明亚硝酸盐出现积累并不是来自自养硝化作用，而是好氧反硝化菌反硝化能力受限，亚硝酸还原酶活性被抑制进而影响了亚硝酸的还原，因此出现小幅积累现象.
图3 AOB和NOB相对数量比较
3.2 以硝酸盐为氮源废水的好氧反硝化研究
3.2.1 物质去除过程与分析
图 4a和4b分别为氮类物质和碳类物质去除及转化趋势.由图 4a可知，在0~6 h阶段，硝酸盐缓慢下降而亚硝酸盐在开始小幅上升后即基本不变.这一阶段变化表明，由于流离填料取自城市污水反应器，原水的氮源特征发生改变，好氧反硝化菌需要调整以适应新的氮源环境;而亚硝酸盐未产生积累可能是亚硝酸盐还原酶在硝酸盐还原酶同时存在时具有较高的反应活性，经硝酸盐还原酶产生的亚硝酸盐在较高活性的亚硝酸盐还原酶作用下被迅速还原;同时这一阶段有机碳的消耗量也较低(图 4b).
图4 物质浓度和运行参数变化趋势
图 4a所示，在6~9 h阶段，硝酸盐被迅速去除，浓度从22.16 mg · L-1降低到3.80 mg · L-1;在9~14 h阶段，硝酸盐去除趋势减缓，曲线斜率远小于6~9 h阶段;直到17 h时，硝酸盐去除率达到100%.与之对应的是，在6~13 h阶段，亚硝酸盐开始出现积累，浓度从1.24 mg · L-1升高至16.76 mg · L-1;紧接着在13~14 h，亚硝酸盐去除至0.84 mg · L-1，去除率接近100%.另外如图 4b所示，在硝酸盐去除和亚硝酸盐积累并进而快速去除这一阶段，有机碳消耗接近100%，表明在好氧反硝化菌作用下，硝酸盐类物质和有机碳被消耗.但是在硝酸盐去除过程中发生了明显的亚硝酸盐积累，积累量是硝酸盐还原量的72.80%，这与一些研究发现的硝酸盐去除过程中无亚硝酸盐积累的结果相反.分析原因是，亚硝酸还原酶承担将亚硝酸盐还原的功能，但亚硝酸盐在溶液中会产生游离亚硝酸(FNA)，FNA有较强的生物毒性，对微生物的生长代谢产生抑制作用.这可以解释为什么硝酸盐的快速去除过程在9 h后被终止，9 h后基本是缓慢去除过程.另外，好氧反硝化菌也需要合成多种酶和细胞组分以适应新出现的亚硝酸盐环境.当菌群适应新的氮源后，仅在1 h内亚硝酸盐去除率即接近100%.
3.2.2 反应器运行状态
试验中发现，整个反应过程中无机碳浓度明显升高，这也许可以从图 4c中找到原因.图 4c为反应器内持续18 h的温度、溶解氧和pH的变化趋势.pH呈逐渐上升趋势，从试验开始的7.80升至试验结束的8.53;而随着pH值的升高，水中溶解的CO2增多，无机碳也相应升高.另外，为考察高温条件下好氧反硝化菌的适应能力，温度在试验全程维持较高水平，同时也使CO2的溶解性提高，进一步提高了水中无机碳的浓度，与图 4b中的无机碳浓度变化趋势符合.溶解氧在6~14 h内波动明显，与这一时间段硝酸盐和亚硝酸盐的快速去除也相吻合，表明好氧反硝化菌在去除硝酸盐类物质时，作为电子受体的O2也同时被还原.
3.3 以亚硝酸盐为氮源废水的好氧反硝化研究
3.3.1 物质去除过程与分析 图 5a和5b分别为氮类物质和碳类物质去除及转化趋势.由图 5a可知，在0~3 h阶段，亚硝酸盐浓度由20.92 mg · L-1降至13.26 mg · L-1，硝酸盐浓度由9.20 mg · L-1升至17.16 mg · L-1.这是由于亚硝酸盐浓度较高时诱导了亚硝酸氧化酶，将部分亚硝酸盐氧化为硝酸盐(张培玉等，2010);亚硝酸盐被氧化的量比硝酸盐的增加量少0.3 mg · L-1，表明有极少量的亚硝酸盐被好氧反硝化菌还原，这与图 5b中这一时间段有机碳的少量消耗相符.
图5 物质浓度和运行参数变化趋势
在3~6 h阶段，亚硝酸盐浓度微下降，硝酸盐浓度小幅上升.6~7 h内硝酸盐浓度大幅度下降，去除率达到80%以上，同时亚硝酸盐浓度升至高点.分析原因，一是由于硝酸盐具有较高的氧化还原电位，利用其作为电子受体时基质释放的能量较高;另外Frette等认为理论上硝酸盐还原产生的能量是亚硝酸盐还原产生能量的3.8倍，根据优先利用原则，当水中同时存在硝酸盐和亚硝酸盐时，反硝化菌优先利用硝酸盐进行好氧反硝化.二是由于亚硝酸盐是硝酸盐反硝化过程的中间产物，其浓度过高时易对硝酸盐还原为亚硝酸盐这一步骤产生抑制作用，从而降低硝酸盐的还原量，这可以解释为什么硝酸盐快速去除只持续了1 h就进入缓慢去除过程，而这个时间点正是亚硝酸盐浓度的高点.说明过高的亚硝酸盐浓度抑制了硝酸盐的还原过程.随后的7~14 h内，硝酸盐去除达到100%;随着硝酸盐的去除接近完成，亚硝酸盐去除从13 h开始，1 h内去除率即达到100%.如前所述，亚硝酸盐产生的FNA有毒，好氧反硝化菌需要时间合成酶和细胞组分，这一过程持续了11 h.而且在同时存在硝酸盐和亚硝酸盐的环境中，二者去除的速度(总共14 h)比单一硝酸盐(18 h)时更快.
在反应过程中，部分时间点检测到微量的氨氮存在.虽然少量的氨氮会促进还原酶的合成和硝酸盐类的去除，但氨氮只在部分时间点检测到，无特定的规律，所以这种促进作用是否存在于本试验研究中并不能确定.
3.3.2 反应器运行状态
图 5c为反应器内持续24 h的温度、溶解氧和pH的变化趋势.试验中，pH呈逐渐上升趋势，从试验开始的7.71升至试验结束的8.41，表明反硝化作用在持续稳定进行.溶解氧在6~14 h内波动明显，与这一时间段硝酸盐和亚硝酸盐的快速去除相吻合.表明好氧反硝化菌在去除硝酸盐类物质时，作为电子受体的O2也同时被还原，这与前文硝酸盐为氮源的试验现象一致.
3.4 好氧反硝化菌的鉴定
污泥样品取自好氧反硝化试验结束后的流离填料生物膜.图 6为应用反硝化菌基因片段和GenBank数据库所获得的反硝化菌系统发育树. 检测到的反硝化菌经文献比对得知：其中FN555565.1、 FN555559.1、FN555558.1，AY078272.1、AY078256.1、AM230913.1、AM230896.1为好氧反硝化菌;GQ384052.1、EF558380.1、EF558490.1为异养硝化-好氧反硝化菌;其它细菌暂时为性状不明的反硝化菌，暂时无文献比对结果.鉴定结果表明，随着水环境中氮源类型的变化，流离填料生物膜内好氧反硝化菌的种属发生变化以适应新氮源环境，与本试验研究开始时所用的流离填料生物膜内的菌属有一定区别;部分菌群具备异养硝化能力，可以解释在处理低碳氮比废水时0~10 h内总氮和有机碳源变化趋势的相关性.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
图6 反硝化菌的系统发育进化树
4 结论
研究了生物膜内功能菌群为整体研究好氧反硝化特征.在低碳氮比废水的试验研究中发现，反应阶段被分为异养硝化-好氧反硝化和自养硝化-好氧反硝化两阶段，但均符合同步硝化反硝化特征.在以硝酸盐和亚硝酸盐分别为氮源的废水反硝化试验研究发现，好氧反硝化菌对氮源的利用有先后之分;硝酸盐去除过程中会出现亚硝酸盐的积累，这是不同还原酶之间相互抑制的作用.在亚硝酸盐和硝酸盐同时存在条件下，二者去除速率(14 h)比单一硝酸盐(18 h)的去除更快;好氧反硝化菌对氮源的改变有一个适应过程.以上结论均在高温(>40 ℃)条件下得出.综上，以整体菌群代替单一菌株的好氧反硝化试验研究，并在相对恶劣的水环境下进行，有助于考察好氧反硝化菌应用于实际污水处理设施中的可能性.