1 引言
活性污泥是微生物与悬浮物质、胶体物质混凝交织在一起所形成的絮状物质，它的结构和功能的中心是菌胶团.在菌胶团上，生长着细菌、真菌、原生动物和某些后生动物，这些微生物能分泌具有粘着性的胶状物质，对微小颗粒和可溶性有机物有强烈的吸附能力，在水流的作用下与悬浮颗粒相碰撞、粘连，形成活性污泥絮体.通过重力作用进行泥水分离是活性污泥处理系统中的重要环节，污泥的沉降性能决定了处理工艺的整体效率.已经被研究的影响污泥沉降性能的主要因素包括：丝状菌含量、絮体的粒径分布、絮体的表面电荷和絮体的亲疏水性等.目前普遍认为，丝状菌数量增多时，絮体变得松散.絮体的表面净负电荷可以在絮体之间产生排斥势能，使絮体难以进一步接触凝聚.絮体的亲疏水性决定了其内部的含水率，含水率越高污泥比重越小.胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)是微生物所分泌的覆盖在细菌细胞壁外的高分子物质，它的含量和组成对活性污泥的絮体结构、表面电荷、亲疏水性和沉降性能都有很大影响.此外，微生物群落结构也是影响活性污泥处理系统正常运行的重要因素.微生物种群丰富意味着其内部贮存着可以在不同环境下生长具有不同特性的微生物，因此，可以抵抗环境的剧烈变化.微生物种群丰富强化了其对特定功能的保持及对冲击负荷的快速恢复能力，同时丰富了基质的利用途径.
在生物流化床处理工程泥水分离区中，基于不同流体运动速度，污泥相存在比重方面的差异，密实型絮团沉在底部，颗粒大，而在反应器的顶部，通常会出现少量污泥游离于上清液中难以沉降.因此，可以通过沉降作用或流体力场分离作用实现基于上述现象污泥的异质性分离，由此，本文把通过异质性分离得到的沉降速度快慢不同的污泥分别定义为聚结型污泥与离散型污泥，探究所分离的污泥在活性、胞外聚合物与微生物群落结构方面是否存在内部相关性.离散型污泥与聚结型污泥相比，其絮体颗粒更小，结构更松散.目前还没有发现针对生物流化床处理系统活性污泥的这种异质性加以研究的文献报道.为了初步考察聚结型污泥与离散型污泥的活性差异，本文采用连续稳定运行3年以上的焦化废水处理工程好氧工艺的混合液作为研究对象，该生物处理单元采用流化床结构，生物流化床通过置入轴向内导流筒使气液固三相在反应器内循环运动.混合液在强大的气流冲击性下呈流化态，因此，污泥呈絮体状.利用旋流离心的方法分离出离散型絮状污泥，以聚结型絮状污泥作为对照，在异质性方面考察两种污泥在EPS、微生物活性和微生物群落结构方面的差异.其中，微生物活性用有机物平均降解速率和比耗氧速率来表征.上述研究工作的动机是，若能够证明在废水生物处理工程中存在污泥的异质性，而又可以通过工程手段应用污泥的异质性，则有可能调控生物处理系统使之处于污泥性质分配功能化的过程，有选择性地从反应器中识别污泥龄长的老化污泥，由此保持系统内的高活性.
2 材料与方法
2.1 污泥的采集与分离
本研究采集的水样与活性污泥样品均来自宝钢集团广东韶钢焦化厂酚氰废水处理站，该废水处理站始建于2004年，由本团队提供技术并设计，生物处理水量为70~80 m3 · h-1，处理出水稳定在《炼焦化学工业污染物排放标准》(GB16171—2012)限值以内.本研究从二级好氧池采集泥水混合液20 L，将混合液倒入水桶中，使用木棒缓慢搅动，利用离心作用分离污泥.从水桶边缘采集到的污泥为比重更大的聚结型污泥，从水桶中央采集到的污泥为比重更轻的离散型污泥.采集污泥后立即测定污泥常规指标.
2.2 有机物降解实验
通过比较两种污泥的有机物降解速率来考察微生物活性的差异，具体做法为：通过离心机将聚结型污泥与离散型污泥脱水，得到含水率基本一致的湿污泥.将焦化废水原水稀释1倍，调节pH至7.0~7.5，按C ∶ N ∶ P=100 ∶ 5 ∶ 1的比例添加KH2PO4，获得实验废水.摇瓶实验设置4组对照组，所添加的湿污泥分别为3.0、6.0、9.0、12.0 g.投加配制好的实验废水250 mL，摇匀后立即从各摇瓶中取混合液100 mL测定MLSS和MLVSS. 随后用薄膜和纱布封口，放入摇床中，温度和转速分别设为(30.0±1.0)℃和200 r · min-1.定时取样检测COD和TOC浓度，有机物平均降解速率按式(1)和(2)计算.
式中，[COD]0、[TOC]0和[COD]t、[TOC]t分别为某一时间段内初始时和终止时的COD和TOC浓度(mg · L-1)，t为间隔时间(h)，[MLVSS]为挥发性悬浮固体浓度(mg · L-1).
2.3 测试方法 2.3.1 常规指标
pH值、COD、MLSS、MLVSS均参照《水和废水监测分析方法(第4版)》测定，TOC采用岛津TOC-VCPH测定. 2.3.2 胞外聚合物(EPS)取2.1节中分离得到的聚结型污泥与离散型污泥各50 mL，在4 ℃下以5000 r · min-1离心20 min，得到污泥上清液经0.22 μm滤膜过滤，用于Soluble EPS的测定.弃去剩余上清液，以蒸馏水补足到原体积，充分混匀后加盖密封，在80 ℃恒温水浴锅中加热40 min后，在4 ℃下以5000 r · min-1转速离心20 min，得到上清液经0.22 μm滤膜过滤，用于Bound EPS的测定. EPS中的多糖与蛋白质的测定分别采用硫酸苯酚法和考马斯亮蓝G-250染色法.
2.3.3 比耗氧速率
将2.1节中分离得到的聚结型污泥与离散型污泥闷曝2 h，取20 mL污泥于血清瓶中，添加20 mL已配制好的焦化废水原水和80 mL已曝气至饱和溶氧状态的蒸馏水，置于恒温磁力搅拌装置中，用磁力搅拌器将污泥混匀，温度控制在(25.0±1.0)℃.密封瓶口，在线记录DO变化曲线.内源呼吸对照组则不添加焦化废水原水，直接添加100 mL已曝气至饱和溶氧状态的蒸馏水.测试结束后，测定污泥MLVSS并按式(3)计算比耗氧速率(SOUR).
式中，[DO]0、[DO]t分别为测定初始时和终止时的溶解氧浓度(mg · L-1)，t为测定时间(h)，[MLVSS]为挥发性悬浮固体浓度(mg · L-1).
2.4 微生物群落结构分析 2.4.1 基因组DNA的提取
将2.1节中分离得到的两种污泥抽滤脱水获得干污泥，各取100.0 mg干污泥，使用Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)，通过Buffer SCL裂解样品，释放基因组DNA，然后通过Buffer SP和氯仿去除蛋白质的干扰. 抽提获得的DNA样品贮存于-20 ℃冰箱中，用于后续PCR扩增. DNA样品用1.5%琼脂糖凝胶进行检测. 2.4.2 PCR扩增 总细菌的PCR扩增采用对大多数细菌和古细菌16S rDNA基因V3区都具有特异性的引物对F341-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGG CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和R534(5′-ATTACCGCGGCTGCTG G-3′)，氨氧化菌的PCR扩增采用对氨氧化菌具有特异性的引物对CTO189f(5′-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GAGAAAAGCAGGGGATCG-3′)和CTO654r(5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′.反应采用50 μL体系：2 μL DNA模板，2 μL上游引物，2 μL下游引物，25 μL Taq PCR Master Mix，19 μL无核酸双蒸水. PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶进行检测.
2.4.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
采用Bio-rad公司Dcode突变检测系统对PCR反应产物进行分离，凝胶浓度为8%，变性剂浓度为30%~60%，温度60 ℃，在60 V的电压下电泳12 h. 结束后，将凝胶进行银染，待条带出现后拍照，在凝胶成像系统上成像检测，获得DGGE图谱. 随后用75%酒精消毒后的手术刀切下DGGE凝胶条带，回收保存于200 μL薄壁管，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆测序. 2.4.4 DGGE图谱条带分析 利用Quantity One软件对DGGE图谱中条带的位置及强度进行模拟分析，得到各条带的波峰面积，利用Shannon指数(H)来评价污泥样品的微生物丰富程度，计算公式为：
式中，ni为峰面积，N为所有峰的总面积.
利用戴斯系数(Cs)评价污泥样品之间微生物种群的相似性，计算公式为：
式中，j为泳道A和B的共有条带的数量，a和b分别是泳道A和B中的条带数.
将测序结果进行处理后提交到GenBank数据库，采用BLAST进行目标序列和基因库中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 污泥形态与特性比较
通过旋流分离装置分离得到聚结型污泥与离散型污泥后立即进行扫描观察，结果如图 1所示.由图 1可知，两种污泥均呈絮体状，外型不规则.相比而言，聚结型污泥结构更为密实，絮体之间连接紧密，而离散型污泥絮团较小，结构更为松散.两种污泥常规指标如表 1所示，离散型污泥与聚结型污泥SVI值分别为78.9与56.0 mL · g-1. SVI即污泥体积指数，是衡量活性污泥沉降性能的指标，聚结型污泥SVI值低于离散型污泥表明其污泥沉降性能更好，污泥比重更大.
采用2.3.2节中所述方法测定两种污泥的胞外聚合物，结果如图 2所示.胞外聚合物是微生物细胞分泌的粘性物质，主要成分为多糖和蛋白质等物质.其中，Bound EPS主要是紧密结合在细胞外壳的束缚性聚合物及附着有机物，Soluble EPS主要是可溶解的大分子物质、胶体和粘液. 数据显示，离散型污泥单位质量MLVSS中的Bound EPS和Soluble EPS更高，这一结果与其他学者的研究结果相符.EPS的含量与污泥的沉降性能呈负相关.离散型污泥EPS含量更高，导致污泥表面电负性较大，絮体表面的净负电荷可以在絮体之间产生排斥势能，导致污泥结构变得松散.
3.2 污泥有机物降解速率及耗氧速率比较
设置4组不同污泥浓度的对照组(表 2)，添加配制好的实验废水，进行有机物降解实验，计算得到COD、TOC平均降解速率如表 3和表 4所示.
COD与TOC存在一定的相关性，实验结果中二者在数值和变化规律上基本吻合.结果表明，在最初的8 h中，降解速率较低，大部分有机物在8~20 h中得到降解.对照组1由于污泥浓度小，有机物负荷更高，因此，每克污泥有机质所降解的有机物更多，其降解速率最大值出现在16~20 h. 对照组2、3、4降解速率最大值出现在8~16 h. 在这个时间段中对照组1中离散型污泥降解速率更高，而在对照组2、3和4中聚结型污泥降解速率更高.由于微生物活性差异较小，因此，在对照组1和2中两种污泥的有机物平均降解速率没有明显规律，而在高污泥浓度的对照组3和4中，有机物平均降解速率呈现的规律较为明显，离散型污泥的有机物平均降解速率要低于聚结型污泥.
微生物内源呼吸是指在没有其他基质可以利用的情况下微生物通过消耗内在储存的物质完成生命活动，而外源呼吸是指在添加实验废水后微生物利用外界供给的物质进行代谢活动，此时内源呼吸并不显著. 实验所采集的污泥为好氧污泥，微生物在降解有机物和硝化过程中都要消耗氧气.微生物的新陈代谢速率可以通过耗氧速率来反映.本文测定了两种污泥在内源呼吸时和外源呼吸时的比耗氧速率，结果如图 3所示.聚结型污泥无论是内源呼吸还是外源呼吸时的比耗氧速率都要高于离散型污泥，说明其微生物活性更高.
3.3 污泥中微生物群落结构分析
焦化废水是由原煤的高温干馏、煤气净化和化工产品精制过程中产生的一种成分极为复杂的废水，除了氨、氰、硫氰根、氟化物等无机污染物外，还含有酚、油、胺、萘、吡啶、喹啉、蒽等杂环及多环芳香族化合物(PAHs). 在生物处理系统中多种微生物以废水中有机物及无机成分为营养物质，在系统中大量繁殖，形成了较为稳定的生态系统.DGGE图谱中处于不同位置的条带代表一个可能的细菌类群或可操作分类单位(Operational Taxonomic Unit，OTU)，条带越多说明生物多样性越丰富，条带染色后的荧光强度则反应该细菌的丰富度，条带信号越亮，表示该种属的数量越多，从而反映污泥中微生物的种类和数量.通过条带的信号强度可以看出处于优势地位的微生物种群.
总细菌DGGE图谱如图 4a所示，对比两种污泥的微生物群落结构可以看出，离散型污泥与聚结型污泥内部微生物群落结构存在差异，二者的相似度以戴斯系数表示，为72.7%.在聚结型污泥DGGE泳道上观察到40条不同的条带，计算得到其Shannon指数为2.15. 在离散型污泥DGGE泳道上观察到27条不同的条带，其Shannon指数为1.55，表明聚结型污泥内部微生物种群更为丰富，而离散型污泥上所附着的微生物种类更少，某些微生物种群在离散型污泥中丰度很低，如B and 1、2、3、4、5、21、27. 因此，离散型污泥中的微生物种类较少决定了其在抗干扰能力和基质利用途径方面与聚结型污泥存在差异. 两种污泥内部优势种群也存在差异，离散型污泥中优势种群为B and 9、11、12、20、24、25，聚结型污泥优势种群为B and 7、10、11、17、20、23、25.图谱中的条带经克隆测序后将序列信息提交到GenBank数据库中比对，所有的条带均在GenBank数据库中找到了同源性很高的种群. 如表 5所示，大部分菌种为未鉴定或培养的菌种，分布于不同的纲及属. B and 19、23、25、26、27、31、32属于变形菌纲(Proteobacteria). B and 1经比对鉴定其序列与硫杆菌属(Thiobacillus sp.)细菌接近，同源性为100%，该菌可以将废水中还原态硫化物氧化为硫酸盐. 与B and 3同源性达99%的Diaphorobacter sp.是一种苯酚降解菌. 数据库中与B and 4同源性最高的是Uncultured Bacteroidetes bacterium clone CG38，该菌种是在负载不同电极材料的微生物燃料电池当中发现的. B and 21与Sphingopyxis sp.的同源性达到100%，该菌种是从石油污染土壤和石油废水中筛选得到，经研究鉴定为高效多环芳烃降解菌.上述的3株菌种已经被发现和鉴定为对污染物的去除具有主要作用的菌群，因此，与焦化废水中污染物的去除有直接的联系，它们均出现在聚结型污泥的DGGE图谱中，但在离散型污泥中丰度很低，这与两种污泥在有机物降解速率上的差异有着密切的联系.
韶钢焦化厂酚氰废水处理站一期工程一级好氧池中大部分易降解有机物和部分可降解的有毒物质得到去除，同时，氰化物、硫氰化物被氧化为氨氮，二级好氧池主要是负责氨氮的硝化，因此，其内部含有丰富的氨氧化菌.氨氧化菌的DGGE图谱如图 4b所示，聚结型污泥内部氨氧化菌种群比离散型污泥更为丰富，两者的Shannon指数分别为0.90和0.60. 将氨氧化细菌的主要条带进行克隆测序，经条带克隆测序鉴定得出二级好氧池污泥中氨氧化细菌主要为β-变形亚纲中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，如B and 1、3、4、6、8. B and 5为亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira). B and 2与Uncultured bacterium clone LR A2-14同源性达到97%，该克隆序列是在A2O焦化废水处理工程好氧池的污泥中发现的.基因数据库中与B and 3最为相似的序列是Uncultured Nitrosomonas sp. clone R1-1，该克隆序列是在脱氮生物反应器的污泥中提取的，该反应器以喹啉为目标降解物. B and 3、4、6、7为二者所共有，B and 1、2、5、8所代表的微生物菌属在离散型污泥中丰度很低.活性污泥中氨氧化菌种类越少，对复杂环境的适应能力就越弱，其硝化作用的抗干扰能力也越弱.
4 结论
1)生物流化床处理系统污泥中存在着离散型污泥与聚结型污泥的异质性，前者结构松散、沉降性能较差，后者结构密实，沉降性能较好.造成两种污泥在性状和沉降性能上的差异初步认为是由其中EPS含量的高低所造成.聚结型污泥较离散型污泥有更强的基质降解能力，更高的内、外源呼吸比耗氧速率.由此推测出沉降性能好即比重大的聚结型污泥表现出比离散型污泥更高的活性.这种异质性的存在对于提高生物反应器的处理效率具有实质性意义.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
2)生物流化床处理系统中污泥异质性的存在还表现在内部微生物群落结构在种群丰度上的差异.无论是总细菌还是氨氧化菌，聚结型污泥的群落结构比离散型污泥更为丰富.聚结型污泥总细菌DGGE图谱中存在3株已经被发现和鉴定为对污染物的去除具有主要作用的菌群，而它们在离散型污泥中丰度很低;聚结型污泥中氨氧化细菌的优势种群为β-变形亚纲中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)，而离散型污泥中亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)丰度很低，未出现在DGGE图谱中.