1 引言
酸雨是全球性三大主要环境污染之一，不仅能直接伤害农作物，如抑制植物生长发育，降低产量与品质，还能间接通过改变土壤性质及影响土壤微生物活性并影响农作物，已成为制约农业生产的重要因素.面对我国酸雨区面积不断扩大的严峻现实，减轻酸雨对植物的伤害已成为保障粮食安全的重要论题.有关稀土农用的研究显示，稀土可增强植物对冷冻、干旱、重金属、紫外辐射、酸雨等胁迫因子的耐受能力，这与稀土增强植物光合作用，促进营养吸收，稳定细胞膜结构，以及提高抗氧化能力等有关.质膜H+-ATPase被誉为植物的主宰酶，参与转运胞内H+和植物对逆境胁迫的响应.课题组前期研究显示，酸雨胁迫会引起水稻叶片中质膜H+-ATPase活性变化，在一定范围能调节胞内pH，维持胞内物质稳定，从而增强植物对酸雨胁迫的耐受性.那么稀土增强植物耐酸性是否与质膜H+-ATPase活性变化有关?既然稀土能通过稳定膜结构来缓解非生物胁迫的伤害，且质膜H+-ATPase活性又与质膜环境密切相关，那么稀土对酸雨胁迫下质膜H+-ATPase活性的调节是否也与质膜环境有关?明晰这些问题，不仅对揭示质膜H+-ATPase在植物对酸雨适应性机制中的作用至关重要，也可为形成化控减灾的有效途径提供理论依据.鉴于此，本文选取重要粮食作物水稻作为研究对象，以相对生长速率、质膜H+-ATPase水解活性与胞内H+荧光强度、CAT活性、H2O2、MDA含量和质膜脂肪酸组成为研究内容，探讨镧对酸雨胁迫下水稻叶片质膜H+-ATPase活性的影响机制，以期为丰富稀土增强植物耐酸性机制提供基础数据，也为寻求化控减灾的有效措施提供新的思考方向.
2 材料与方法
2.1 试材培养
供试水稻(Oryza sativa)品种为淮稻8号.挑选籽粒饱满的种子用0.1%HgCl2消毒10 min，去离子水浸泡后于25 ℃恒温光照培养箱中催芽2 d，待幼苗长至2叶1心时移入6.88 L周转箱中水培，营养液采用国际水稻研究所(IRRI)常规营养液配方，并略作修改.Fe以Fe-EDTA形式加入，保持营养液中Fe浓度为2.0 mg · L-1，并加入NaSiO3 · 9H2O保持营养液中SiO2浓度为120 mg · L-1，NH+4-N中加入5.89 mg · L-1双氰胺作为硝化抑制剂.每次用H2SO4或NaOH将营养液pH调至5.5，营养液每隔3 d更换1次.培养光照强度为300 μmol · m-2 · s-1，光照12 h，昼/夜温度为30 ℃/24 ℃，相对湿度为60%.待幼苗长至3叶1心时，选长势相近的幼苗进行处理.
2.2 试材处理
配制LaCl3溶液(15 mg · L-1).配制pH=1.0的模拟酸雨母液(SO42-/NO3-，3 ∶ 1，V/V)，用母液配制成pH=3.5、2.5的模拟酸雨溶液.用喷雾器先将LaCl3溶液均匀喷施于叶片，滴液为限，待叶面干涸后，将酸雨用同样的方法喷施于叶片，对照(CK)喷施等量蒸馏水，连续处理5 d.处理结束后，取每株从上到下数第二叶位的叶片进行指标测定.实验处理设置：CK、pH=3.5 AR、pH=2.5 AR、La(15 mg · L-1)、La+pH 3.5 AR、La+pH 2.5 AR处理组.
2.3 指标测定方法
相对生长速率测定参考文献方法;质膜H+-ATPase活性参照文献方法;用酶解法提取水稻叶片原生质体，用BCECF-AM荧光探针染料标记细胞，通过流式细胞仪测定胞内H+荧光强度来表示胞内H+浓度;采用高锰酸钾滴定法测CAT活性和采用硫酸钛法测H2O2含量;采用硫代巴比妥酸法测MDA含量;采用气相色谱测定质膜脂肪酸组成.
2.4 数据处理与分析
所有数据均为3次独立试验的平均值±标准误差(Mean±SD)，所有原始数据的平均值、标准误差和差异显著性用 SPSS16.0软件分析.数据制图在Origin8.0软件中完成.
3 结果与分析
3.1 镧对酸雨胁迫下水稻相对生长速率的影响
植物相对生长速率常用来表征植物的抗逆能力，即胁迫下植物生长的快慢.由图 1可知：单一AR组水稻相对生长速率较CK分别降低24.7%(pH=3.5)和45.89%(pH=2.5);单一La组水稻相对生长速率较CK升高19.86%.La+pH 3.5组水稻相对生长速率与CK无显著差异，较单一pH=3.5组升高18.03%，表明La缓解了pH=3.5 AR对水稻造成的伤害，这与周青的研究结果一致.La+pH 2.5组水稻相对生长速率较CK降低42.47%，与单一pH=2.5 AR组无显著差异，表明La对pH=2.5 AR组造成的伤害未能起到缓解作用，推测可能是pH=2.5 AR严重破坏了水稻叶片光合系统，而此伤害已经超出了La对光合系统的调控范围，从而使水稻生长受到抑制.
图1 镧对酸雨胁迫下水稻相对生长速率的影响(图中数据为平均值±标准误差，不同字母表示各处理间差异显著(p<0.05)，下同)
3.2 镧对酸雨胁迫下水稻叶片质膜H+-ATPase活性和胞内H+荧光强度的影响
质膜H+-ATPase 能利用 ATP 水解释放的能量调控细胞内H+的平衡，以维持细胞内环境的稳定.由图 2a可知，单一AR组水稻叶片质膜H+-ATPase活性较CK分别升高8.22%(pH=3.5)和降低27.40%(pH=2.5).单一La组质膜H+-ATPase活性较CK升高13.01%.La+pH 3.5 AR组水稻叶片质膜H+-ATPase活性较CK与单一pH=3.5 AR组分别升高26.03%和16.46%，推测可能是La作为一种效应物与质子泵C末端结合，解除其自抑制功能，从而增强了质膜H+-ATPase活力表达.La+pH 2.5 AR组水稻叶片质膜H+-ATPase活性较CK降低19.86%，与单一pH=2.5 AR组无显著差异.质膜H+-ATPase活性受转录水平的调节，pH=2.5 AR下调了质膜H+-ATPase的转录水平，尽管La对质膜H+-ATPase的转录水平有上调作用，但最终La+pH 2.5 AR组H+-ATPase活性降低，表明La对AR胁迫下质膜H+-ATPase活性的调节受AR强度的制约.
图2 镧对酸雨胁迫下水稻叶片质膜H+-ATPase活性(a)和胞内H+荧光强度(b)的影响
胞内H+荧光强度增强表明胞内H+增多.由图 2b可知，单一AR组水稻叶片胞内H+荧光强度较CK分别升高34.12%(pH=3.5)、69.88%(pH=2.5).单一La组胞内H+荧光强度较CK降低12.04%.La+pH 3.5 AR组水稻叶片胞内H+荧光强度较CK和单一pH=3.5 AR组分别降低21.69%和41.96%，结合质膜H+-ATPase活性变化可知，可能是由于质膜H+-ATPase活性升高，胞内过多的H+被泵至胞外，维持了细胞内环境的稳定，使水稻恢复生长.La+pH 2.5 AR组水稻叶片胞内H+较CK升高38.52%，而与单一pH=2.5 AR组无显著差异，分析可能是由于质膜H+-ATPase活性受抑制，大量H+在胞内积累，使水稻的生长受到抑制.表明La调节植物耐酸性与调控质膜H+-ATPase活性有关，调控效果受AR强度限制.
3.3 镧对酸雨胁迫下水稻叶片膜脂过氧化与质膜脂肪酸组成的影响
CAT是植物体内重要的抗氧化酶，可以分解植物体内代谢过程中产生的H2O2.MDA是细胞膜脂过氧化的产物之一，其含量升高表示细胞膜脂过氧化程度加重.由表 1可知：单一pH=3.5 AR组CAT活性、H2O2和MDA含量和较CK分别升高7.99%、12.24%和34.25%.单一pH=2.5 AR组CAT活性较CK降低40.57%，H2O2和MDA含量较CK升高44.90%和70.92%.单一La组水稻叶片CAT活性较CK升高26.43%，H2O2和MDA含量较CK分别降低32.65%和28.30%.La+ pH 3.5 AR组水稻叶片CAT活性较CK升高32.38%，H2O2和MDA含量较CK无显著变化，且与单一pH=3.5 AR组相比，CAT活性升高22.58%，H2O2和MDA含量分别降低19.57%和28.99%，推测可能是由于La改变了CAT的空间折叠态和卟啉活性中心的易变性，使CAT活性增强并清除体内过多的H2O2，降低了膜脂过氧化程度.La+ pH 2.5 AR组水稻叶片CAT活性较CK降低37.91%，H2O2和MDA含量较CK升高38.78%和61.51%，但与单一pH=2.5 AR组相比，3个指标均无显著变化.严重玲等研究显示，酸雨强度越大，作物对稀土的吸收和利用越少.本研究结果显示：在pH=2.5 AR胁迫下，水稻叶片对La的吸收和利用量减少，La未能提高CAT活性，过多的H2O2造成了膜脂过氧化，产生过量的MDA，而MDA可能抑制膜上蛋白的合成，进而导致质膜H+-ATPase活性的降低.pH=3.5 AR胁迫下，La能促进CAT活性升高，清除过多的H2O2积累，减轻质膜过氧化.pH=2.5 AR引起的H2O2积累不仅抑制了CAT活性，也超出了La的清除能力.
表1 镧对酸雨胁迫水稻叶片中CAT活性、H2O2和MDA含量的影响
脂肪酸不饱和度指数可用来表征脂肪酸的不饱和程度，IUFA升高表示脂肪酸不饱和程度增加.由表 2可知，单一AR组水稻叶片质膜IUFA较CK分别降低5.32%(pH=3.5)和9.03%(pH=2.5);单一La组水稻叶片质膜IUFA较CK升高3.77%.La+pH 3.5 AR组水稻叶片质膜IUFA较CK无显著差异，但较单一pH=3.5 AR组升高3.32%，结合MDA含量变化可知，La减轻了pH=3.5 AR诱发的膜脂过氧化，质膜流动性增强，使质膜的功能增强，质膜H+-ATPase活性增强.La+pH 2.5 AR组较CK降低10.08%，与单一pH=2.5 AR组无显著差异，推测可能是La未能减轻pH=2.5 AR诱发的膜脂过氧化，膜通透性增大，导致质膜的功能降低甚至丧失，质膜H+-ATPase活性降低.表明La减轻pH=3.5 AR诱发的质膜过氧化，进而维持质膜的流动性，使质膜H+-ATPase保持较高活性;La未能减轻pH=2.5 AR诱发的质膜过氧化，质膜的流动性降低，质膜H+-ATPase活性受抑未能缓解.
表2 镧对酸雨胁迫下水稻叶片质膜脂肪酸组成的影响
4 结论
1)La能缓解pH=3.5 AR对水稻生长的伤害，对pH=2.5 AR的防护效果不明显，显示La对AR胁迫下水稻生长的调节作用受AR强度限制.
2)La促进pH=3.5 AR胁迫下质膜H+-ATPase活性升高，减少胞内H+，缓解AR伤害;而在pH=2.5 AR胁迫下，La对质膜H+-ATPase调控效果不明显，大量H+在胞内积累，表明La调节植物耐酸性与调控质膜H+-ATPase活性有关，调控效果受AR强度限制.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
3)La能通过促进CAT活性来减轻pH=3.5 AR诱发的质膜过氧化，进而维持了质膜的流动性，有助于质膜H+-ATPase保持较高活性;pH=2.5 AR造成的活性氧积累超出了La的调控与清除能力，膜脂过氧化发生，质膜的流动性降低，致使质膜H+-ATPase活性受抑.研究发现，La能改善AR胁迫对质膜环境的影响，进而调节质膜H+-ATPase活性.