1 引言(Introduction)
多环芳烃(PAHs)是一种在海洋底泥中广泛分布的疏水性有机污染物(HOCs)(董军等，2006)，其释放部分易被水生生物富集，从而影响底栖生物生存和经济水产品质量.因此，监测生物体内及其暴露环境中的PAHs含量，对保障养殖区域环境及食品质量安全非常重要.传统的通过测定生物体内残留浓度(Cb，lip)来评价水产品质量及其食用风险的方法，需要使用大量溶剂，处理时间长且操作步骤繁琐，同时受生物种类、性别、生长期和健康状况等因素的影响，导致所获得的数据差别较大(范元中等，2003)，从而影响评价结果的准确性.此外，也可通过监测养殖区域生物暴露环境中(包括生物栖息底泥及孔隙水)污染物的总浓度(陈珊等，2011)，并与底泥质量基准及水环境质量基准对比，评价养殖区域的环境质量及污染物对生物的潜在影响.但此种方法忽视了底泥污染物的生物有效性，监测结果与生物体内残留浓度的相关性较差.
除部分直接以底泥作为食物的生物外，与底泥达到分配平衡的孔隙水中自由溶解态物质，才是底栖生物摄取的主要对象，是污染物在环境中迁移、分配及生物累积的驱动力，因此，底泥孔隙水中自由溶解态污染物浓度(Cfree)的测定越来越受到关注.但在底泥多介质体系中测定Cfree并不容易，传统测定底泥孔隙水中Cfree的步骤包括离心、絮凝和测定.但由于孔隙水中没有任何胶体存在，HOCs在运输和保存过程中会产生不可忽视的损失.近年来，快速发展的以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料的固相微萃取技术能够直接测定Cfree同时，PDMS具有与生物膜相似的性质，也可用于预测底栖生物对污染物的生物富集程度.因该技术具有新颖、廉价和使用方便等特点而越来越受到环境分析化学研究工作者的关注，并得以迅速发展.
本研究以养殖底泥中的PAHs为研究对象，以其在底泥中的生物有效性为切入点，采用以PDMS为材料的固相微萃取技术，当PDMS中PAHs的浓度(CPDMS)与底泥孔隙水中Cfree达到分配平衡时，依据PDMS具有与水生生物脂肪组织对HOCs相似的吸收和溶解特性，以滤食生活、代谢率低且对污染物的生物富集能力强(刘静等，2009)的重要海水经济底栖生物菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)为参照生物，建立代替传统底栖生物用于监测底泥HOCs污染水平的 “虚拟生物”，同时建立PDMS与底泥有机碳标化污染物浓度间的定量关系模型，以期为基于固相微萃取的模拟生物法在养殖区域中有机污染物的监测提供理论基础.
2 材料与方法
2.1 药品与试剂
甲醇、二氯甲烷和正己烷均为色谱纯(Sigma-Aldrich，USA);乙腈和丙酮均为色谱纯(沃凯试剂，中国);氧化铝、佛罗里硅土、层析硅胶(80~100目)、无水硫酸钠与铜粉均为分析纯(阿拉丁试剂，中国).氧化铝、弗罗里硅土、硅胶和无水硫酸钠使用前在马弗炉中650 ℃烘6 h，置于干燥器中备用;铜粉参照EPA 3660A方法进行活化;聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)购自Specialty Silicone Products公司(USA)，使用前切成直径为16 mm的薄片(厚度0.005 英寸，密度0.972 g · cm-3)，用15mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)溶液超声清洗20 min，保存于甲醇/水(V/V，1 ∶ 1)溶液中备用.多环芳烃菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘等标准品(阿拉丁试剂，中国)购自上海晶纯生化科技有限公司.
2.2 底泥采集、分析及加标老化
本实验中所用的底泥采自上海洋山港潮间带表层底泥，其有机碳和黑碳的含量分别为0.45%±0.03%和0.11%±0.01%(李娟英等，2015).本研究选取7种具有不同梯度辛醇-水分配系数(Kow)且检出频率较高的PAHs作为监测对象，并在海洋环境底泥风险评价分级的基础上配置3个浓度梯度，分别为潜在生态风险效应低值(Effects Range Low，ERL，Long et al., 1995)的1、2和3倍.以丙酮为载体，将7种PAHs混合液加入底泥中，混匀，4 ℃避光保存，老化28 d.
2.3 生物累积实验
菲律宾蛤仔购自上海市芦潮港菜市场，在盐度25±2和水温(20±1)℃且连续曝气的条件下驯养3周以上.驯养过程中光周期为16h:8h(光照:黑暗)，每天定时投加定量三角褐指藻进行喂养.菲律宾蛤仔的脂肪含量为0.51%±0.15%(测定方法参考GB/T5009.6—2003).
参照EPA方法(EPA 600/R-99/064)，称取老化后的底泥约2 kg(湿重)放入5 L玻璃缸中，表面覆盖4 L左右的人工海水(用海水素和蒸馏水配制).静置1d后，于每个玻璃缸中放入驯养后活力强、个体大小相近的蛤仔25只(壳长(32±2)mm、壳高(12±2)mm).采用半静水式方法(日换水1/2)(周永欣等，1989)进行累积实验，暴露条件同驯养过程且期间不喂食.实验设置1个空白，每个浓度梯度设置两个平行，持续28 d.实验结束后，将菲律宾蛤仔和底泥取出，冷冻干燥后磨碎备用.
2.4 固相微萃取测定底泥孔隙水中Cfree
根据Li等(2013)的计算方法，称取400 g(湿重)底泥于1 L蓝口瓶中，加入200 mL人工海水(底泥含水率控制在60%~70%)、氯化汞(底泥干重的0.15%)和1片洁净的PDMS薄膜.置于振荡器上连续振荡28 d(20 ℃，200 r · min-1)以达到平衡.设置1个空白对照，每个浓度梯度设置2个平行.
实验结束后，用镊子将PDMS薄膜取出，用超纯水洗净后置于铝箔上晾干，再用15 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)超声萃取2次，将2次萃取液混合后旋转蒸发浓缩至2~3 mL，用柔和的氮气吹至近干，乙腈定容至1 mL，待测.
2.5 PAHs的萃取、净化及测定
本文中PAHs的萃取、净化及测定参照本实验室Li等(2015)的方法.简述如下，称取底泥样品3 g或生物样品1 g放入索氏提取器中，加100 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)，于65 ℃水浴中回流萃取24 h.底泥萃取液过装有4 g无水硫酸钠、4 g氧化铝和8 g中性硅胶的层析柱净化;生物萃取液过装有8 g佛罗里硅土和2 g铜粉的层析柱净化.底泥及生物萃取液均用20 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，用柔和的氮气吹至近干，乙腈定容至1 mL，待测.PAHs的测定采用Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪，DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱进行分离分析.气相条件及质谱条件与Li等(2015)相同.底泥和菲律宾蛤仔样品提取前，进行3个加标浓度梯度样品的回收率实验，回收率平均值为75%~120%，相对标准偏差为7%~12%.所有样品的测定均设置全流程空白实验及两个平行.
3 结果与讨论
3.1 固相微萃取模拟生物法用于底泥孔隙水中Cfree的测定
底泥孔隙水中PAHs总浓度(Cwater)可以通过底泥中PAHs总浓度(CS，OC)及底泥有机碳-水分配系数(KOC)计算得到(表 1).然而，Cwater包括Cfree和溶解性有机碳(DOC)结合态浓度(Allan et al., 2012)，但结合态污染物因其极性太强或者体积太大不能被生物体吸收，即不具有生物有效性.Hunter等(2009)的研究也表明，只有自由溶解态的分子才能够穿过生物膜被生物吸收.与上述方法相比，固相微萃取PDMS中只富集自由溶解态的污染物(Mayer et al., 2003)，因此，可根据PDMS中污染物的浓度CPDMS和PDMS-水分配系数(KPDMS-w)计算孔隙水中的Cfree，从而更真实地反映孔隙水暴露环境中PAHs的生物有效性浓度.
表1 PAHs分配常数及底泥体系各相中PAHs的浓度
以低浓度梯度底泥为例，表 1列出了PAHs的不同分配系数和底泥体系各相中PAHs的浓度.由表 1可知，7种PAHs的Cwater均大于Cfree.徐晓阳等(2010)使用土壤-水相分配系数(Kd)推测的Cwater比使用微萃取方法测得的Cfree大4~5倍，本实验结果与之相似.这与Cwater中既包括自由溶解态的污染物，也包括DOC结合态污染物密切相关(Xia et al., 2013).此外，低环PAHs的Cwater比Cfree大1~2倍，而高环PAHs则大5~10倍，说明随着PAHs环数和疏水性(辛醇-水分配系数Kow)的增加，高环PAHs更倾向于以DOC结合态而非自由溶解态的形式存在于孔隙水中，从而降低其生物有效性.因此，传统使用Cwater评价养殖底泥孔隙水中PAHs暴露水平的方法，因忽视了生物有效性可能导致结果产生偏差.因此，使用以PDMS为材料的固相微萃取模拟生物法测定Cfree，为更好地评估底泥孔隙水中PAHs的真实暴露水平提供了替代方法.
3.2 固相微萃取模拟双壳类生物体内PAHs的富集
底栖生物体内污染物残留水平检测是评价底泥中污染物生物有效性最直接有效的方法(周东星等，2014).由于PDMS基于生物有效性富集底泥中的污染物，因此，具有模拟养殖经济底栖生物体内PAHs残留的潜力.为了确定基于固相微萃取的模拟生物法是否可以模拟菲律宾蛤仔富集底泥环境中的PAHs，需要比较PDMS与菲律宾蛤仔富集底泥中污染物的途径，并进一步建立两者富集程度之间的定量关系.
3.2.1 菲律宾蛤仔与PDMS富集底泥中PAHs的途径比较
生物富集系数(BAF)是生物富集最直观的数字表达，BAF(L · kg-1)可用下式计算得到(Kraaij et al., 2003)：
BAF=Cb，lip/Cfree
式中，Cb，lip为生物体内脂肪标化的污染物含量(ng · g-1，以lipid计)，Cfree为孔隙水中自由溶解态污染物浓度(μg · L-1).
由于Kow是描述污染物在水相和有机相间分配特征的重要参数，且如果某化学物质在水生生物体内的代谢可忽略不计，则化学物质的Kow值越大，其在生物体内生物富集程度越高(胡霞林，2009).本研究中菲律宾蛤仔的BAF值随着Kow的增大而增加(图 1)，且lgBAF与lgKow成显著线性相关(y=x-0.613(R2=0.92，r=0.96，p<0.01)).由于Kow表示化学物质在正辛醇相与水相间达到分配平衡时的浓度比(王翊如等，1999)，因而lgBAF与lgKow的显著相关表明，底泥孔隙水中自由溶解态的PAHs在菲律宾蛤仔脂肪相和孔隙水相之间的分配也达到平衡.
同时，当自由溶解态的PAHs在PDMS相和孔隙水相之间分配达到平衡时，lgKPDMS(KPDMS=CPDMS/Cfree)与lgKow也成显著线性相关(图 1，y=x-0.691，R2=0.978，r=0.99，p<0.01).Porte等(1993)就贻贝、鲻鱼及螃蟹对底泥相及水相中多氯联苯富集的研究发现，对于鲻鱼和螃蟹，底泥相暴露后的lgBAF与lgKow的斜率明显大于水相暴露后lgBAF与lgKow的斜率，说明鲻鱼及螃蟹在底泥暴露过程中，除了富集孔隙水中污染物，还摄取了部分颗粒结合态污染物;而贻贝在两相暴露实验中的所获得的lgBCF与lgKow的斜率相同，表明暴露于底泥中贻贝体内的污染物主要来自孔隙水中的污染物.而本研究中lgBAF与lgKow的线性斜率和lgKPDMS与lgKow的线性斜率相当(图 1)，表明菲律宾蛤仔与PDMS摄取底泥中PAHs的主要途径类似.
图1 lgKow与lgBAF和lgKPDMS的关系
3.2.2 菲律宾蛤仔与PDMS富集PAHs的相关性
为进一步探讨PDMS在复杂体系中模拟菲律宾蛤仔生物富集PAHs的准确性，本研究测定了平衡时3个浓度梯度下PDMS中PAHs的浓度(CPDMS)与菲律宾蛤仔体内PAHs的浓度(Cb，lip)，并对两组浓度进行了回归及相关性分析(图 2)，且通过定量计算得到Cb，lip约为CPDMS的1.0~1.5倍.该定量关系与其他研究者基于PDMS预测疏水性有机污染物(HOCs)在底栖无脊椎生物体内富集的定量关系有所差异，如Leslie等(2002)用PDMS预测摇蚊对底泥中PAHs富集的研究中得出Cb，lip≈8CPDMS.这种差异与受试生物种类有密切关系，不同生物体内脂肪含量不同，而脂肪含量是影响疏水性化学物质生物富集的主要因素(Geyer et al., 1994)，生物体内脂肪含量越大，生物富集程度越高.本研究中菲律宾蛤仔体内的脂肪含量仅为0.51%，与其他生物相比，脂肪含量较低(如摇蚊体脂含量为0.96%，河蚬体脂含量为2.37%);另外，生物体内PAHs的残留浓度与污染物在生物体内可能会发生脂类代谢和生物转化有关，如PAHs中苯并[a]芘会在沙蚕属幼虫体内发生转化(Mcelroy et al., 1989).本实验仅针对PAHs母体化合物开展研究，没有将不同生物体内脂类代谢和生物转化考虑在内.尽管如此，lgCPDMS与lgCb，lip呈显著性相关，意味着基于固相微萃取技术的模拟生物法可以用于海洋双壳类底栖生物体内PAHs母体化合物的残留模拟，且考虑到成本、效率和大范围推广的因素，使用固相微萃取模拟海洋养殖区底泥污染物在底栖生物体内的富集残留和检测较传统方法优势明显.
图2 lgCPDMS与lgCb，lip的关系
3.3 PDMS相与底泥相中PAHs浓度的相关性
上述讨论表明，基于固相微萃取技术的模拟生物法不仅可以计算PAHs在底泥孔隙水中的Cfree，且与菲律宾蛤仔体内生物富集浓度存在显著的相关性，如果能进一步建立和完善PDMS相与底泥相中PAHs浓度间相关关系，就可为基于固相微萃取的模拟生物法在养殖区域中的污染物的监测应用奠定基础.
为此，本研究进行了3个浓度梯度下底泥中OC标化的PAHs浓度(CS，OC)与PDMS中PAHs浓度(CPDMS)的相关性研究(图 3)，结果表明，PDMS中PAHs的浓度同样与底泥中PAHs的浓度(y=0.758x-2.365，R2=0.65，r=0.83，p<0.01)间具有显著相关性，且这种相关关系使得传统CS，OC的总量测定结果可用于底泥污染物生物有效性评价，这对底泥质量标准制定及底泥暴露风险评价具有重大意义.本文中两者间的定量关系为CS，OC≈5CPDMS，与Li等(2013)得出的CS，OC≈2CPDMS稍有不同，但共同点是污染物在底泥中的分配高于PDMS.原因是进入底泥中的污染物，分为快速解吸、慢速解吸和极慢速解吸3种存在状态，甚至部分以不可逆解吸状态存在，3种存在状态下污染物的物理迁移能力、生物有效性及化学反应活性具有差异(Liu et al., 2011)，CS，OC为有机溶剂提取的污染物总浓度，而生物有效部分主要指可快速解吸的污染物，以PDMS为材料的固相微萃取法对污染物的获取或浓缩过程完全基于化合物从化学势或逸度高处(即外界环境基质)向化学势或逸度低处(即采样介质或吸附剂)的自动扩散(陈珊，2011)，其富集的PAHs以容易解吸部分为主，且大量研究表明，生物有效的HOCs主要来源于容易解吸的部分(胡霞林，2009;Reichenberg et al., 2006).因此，根据CS，OC评价底泥污染可能会过高估计底泥暴露环境中PAHs对底栖生物的危害.此外，相关关系之间的这种差异与底泥特性也有密切关系，如底泥OC含量、粒度分布及OC种类(如黑碳和煤)等(Cornelissen et al., 2005)也对PAHs的分配起至关重要的作用，也是今后本课题组将继续深入研究的内容之一.尽管如此，CS，OC与CPDMS的显著相关仍表明基于固相微萃取的模拟生物法可用于养殖区域底泥中PAHs的污染监测.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
图3 lgCPDMS与lgCS，OC的关系
4 结论
1)以PDMS为材料的固相微萃取模拟生物法为准确测定底泥孔隙水中PAHs的Cfree提供了替代方法，Cfree低于Cwater，且环数越高，差异越大.Cfree能更好地反映底泥孔隙水中PAHs的暴露水平，为固相微萃取技术在环境监测中的应用奠定了基础.
2)菲律宾蛤仔对PAHs的富集系数及PDMS-水分配系数均与辛醇-水分配系数呈显著线性相关，且两者的斜率相当，表明菲律宾蛤仔与PDMS摄取底泥中PAHs的途径类似.
3)PDMS中PAHs浓度与菲律宾蛤仔体内残留PAHs及底泥中OC标化的PAHs浓度之间均呈现显著的相关性，定量关系分别为Cb，lip≈1.5CPDMS和CS，OC≈5CPDMS，表明基于固相微萃取的模拟生物法具有在养殖区域有机污染物监测中应用的潜力，但有机污染物在生物体内的转化和底泥性质对监测应用的影响有待进一步研究.