1 引言
强化生物除磷技术(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)由于经济、高效的特点被广泛应用于各大城市污水处理厂.通过分子生物技术已经确认菌群β-Proteobacteria是EBPR活性污泥中的优势聚磷菌(PAOs)，将其命名为C and idatus Accumulibacter(Hesselmann et al., 1999;Crocetti et al., 2000).Accumulibacter 是目前污水生物处理领域广泛认可并且研究最多的一种PAOs(Zilles et al., 2002).ppk1基因可以编码合成poly-P的聚合磷酸盐激酶(PPK1)，其进化速度是16S rRNA 的5倍，是研究Accumulibacter各进化分支很好的基因标记物.McMahon等(2007)基于ppk1的系统发育分析将Type I划分为Type I和Type II，其中，Type I 进一步划分为IA、IB、IC、ID、IE 5个分支;Type II划分为IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF、IIG 7个分支.
现有研究证实，Accumulibacter在污水厂存在很高的多样性，且主要分布于TypeⅡ，但水厂运行与各分支分布的相关性不清楚.宏基因组的研究也证实了分支多样性，这种多样性与污水处理厂的稳定性有一定关系(Albertsen et al., 2012).Mielczarek等(2013)对丹麦28个污水处理厂的研究发现，IA和IIC分支几乎出现在每个处理厂.Peterson等(2008)对美国几个污水处理厂及一些淡水湖泊、河口沉积物样品进行研究发现，IID存在于大部分的淡水、河口沉积物中及少部分污水处理厂中，有的湖泊淡水中仅发现IID 1个分支.由此可见，来自不同地域的污水处理厂，Accumulibacter进化枝的分布有明显差异.对实际污水处理系统中Accumulibacter的研究主要发现了IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF这6个分支，尤其是前5个分支的研究报道较多(He et al., 2007; Gebremariam et al., 2011; McMahon et al., 2007; Mielczarek et al., 2013)，IIF较少存在.而在本研究中IIF在几个污水处理系统中含量丰富，首次作为重点研究.其他6个分支(IB、IC、ID、IE、IIE、IIG)主要存在于自然界的淡水、湖泊、河流沉积物等地方，很少在实际污水处理厂中出现(McMahon et al., 2007).因此，着重关注IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF这6个分支而不是整体的12个分支.关于中国城市污水处理厂中Accumulibacter 6个分支的菌群结构及定量分析的研究尚未见报道.
近年来，许多研究者针对污水处理系统的运行参数和Accumulibacter各分支的组成分布的关系展开研究.关于电子受体的影响，Kim等(2013)认为所有杆状的Accumulibacter分支，包括分支IIC、 IA和IIF在具有足够的硝酸盐还原活性的污泥中可以成功的利用硝酸盐吸磷.Flowers等(2009)发现反硝化吸磷时，IA、IIA分别以硝酸盐、亚硝酸盐作电子受体.Flowers等(2013)在最近的研究中发现，在动力学上Clade IIA活性与温度正相关，而IA与温度呈负相关.迄今为止，究竟有哪些因素主导了实际污水处理系统Accumulibacter的种群结构和动态变化仍然没有确切的研究结果.
本研究选择9个具有代表性的大型市政污水处理厂，分析不同运行状况的污水处理厂活性污泥中C and idatus Accumulibacter主要分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的丰度及分布特点，揭示污水处理厂C and idatus Accumulibacter进化枝水平菌群结构、丰度与工艺运行的相关性.
2 材料与方法
2.1 城市污水处理厂的活性污泥样品
实验所用的污泥样品分别采集于9个污水处理厂，其中有2个水厂各包含2个工艺，共11个工艺.每个工艺取1个污泥样品.其中，针对A2O+纤毛状生物膜(CNR)工艺取2个样品，分别位于加膜区和无膜区，是为了考察加膜对聚磷菌的菌群结构是否有影响，因此，共有12个样品.12个样品依次命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L.其中，B和C取自同一水厂，I和J取自同一水厂，E和F取自A2O+纤毛状生物膜工艺的加膜区和无膜区.污水处理厂的运行参数及进出水指标见表 1.
表1 活性污泥样品对应的污水处理系统的运行参数及进出水指
2.2 DNA提取、PCR、克隆测序
用1×PBS(0.01 mol · L-1，pH=7.2~7.4)清洗污泥样品3次，14000×g离心2 min，去除上清液，置于-20 ℃保存.采用试剂盒(Fast DNA Spin kit for soil，MP，USA)对DNA进行提取.提取后的DNA 通过Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientic，USA)测量核酸浓度及纯度.
特异性正向引物ppk1-254F(TCACCACCGACGGCAAGAC)和反向引物ppk1-1376R(ACGATCATCAGCATCTTGGC)用来扩增总C and idatus Accumulibacter ppk1 基因，片段长度为1123 bp.PCR反应采用试剂盒(Promega GoTaq Green Master Mix，USA)，反应体系为25 μL：12.5 μL GoTaq Green Master Mix，1 μL(10 mmol · L-1)正向引物，1 μL(10 mmol · L-1)反向引物，0.5~2 μL DNA模板，剩余体系用纯水补齐.PCR程序包括：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性45 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环;最后在72 ℃反应5 min.
获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(Agarose MS-6，TaKaRa，Japan)检测，为单一的目的条带，切胶，用Takara Agarose Gel DNA Purication Kit Ver. 2.0(Takara，Dalian，China)纯化.得到的DNA用试剂盒(Zero Background TA Topoisomerase Cloning Kit，Clonesmarter，USA)进行连接转化.连接体系为10 μL，包括1 μL pCloneEZ-TOPO载体，1 μL 10×Enhancer，0.5~8.0 μL DNA，一定量的纯水补齐体系.连接反应完成后将产物加入到感受态细胞DH5a(中美泰和，国产)中进行转化.每个样品随机挑出一定量的阳性克隆子进行测序，构建克隆文库.
2.3 克隆文库建立和系统发育分析
构建文库的序列通过Mothur 软件按照 97%相似度进行 OTU 划分，将每个 OTU 的代表序列与NCBI 数据库中下载的相似性最高最具代表性的菌株序列一起进行比对.采用 MEGA5.0 利用邻接法(Neighbor Joining Method)进行系统发育分析，通过自举分析方法(Bootstrap)检验系统发育树各分支置信度，重复1000次.
2.4 实时定量PCR(QPCR)
采用特异性引物对C and idatus Accumulibacter主要的6个分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的ppk1片段和全菌的16S rRNA进行QPCR扩增(He et al., 2007; Ong et al., 2014).反应在Mx3005P实时定量PCR扩增仪(Agilent Technologies，American)上进行，采用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq kit进行反应，体系为25 μL包括12.5 μL的SYBR缓冲液，正反向引物各1 μL(10 mmol · L-1)，0.5 μL ROX，DNA模板2 μL，剩余体系用纯水补齐.特异性引物序列及扩增程序见表 2.
表2 QPCR各分支的特异性引物序列及扩增程序
本研究采用质粒法制作标准曲线.C and idatus Accumulibacter 6个分支IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF实时荧光定量 PCR 标准曲线中的初始模板浓度与Ct值之间呈现较好的线性关系，R2在0.990~1.000之间，扩增效率在92%~109.7%之间.
2.5 登录号
测得的序列上传至 GenBank 数据库，获得的聚磷菌的序列登录号为：KP147989~KP148181、KT024045~ KT024419.
3 结果与讨论
3.1 12个活性污泥样品中C and idatus Accumulibacter 的定量分析
采用实时定量PCR定量分析Accumulibacter(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)6个分支的丰度，结果如图 1所示.Accumulibacter 6个分支均为单拷贝基因，即Accumulibacter的细胞数为ppk1基因的拷贝数.总Accumulibacter的定量变化范围为7.32×107(D)~3.05×109 cells · g-1(L)，平均为1.20×109 cells · g-1(以MLSS计).在12个样品中，只有D样品数量级为107，比其他样品低1~2个数量级，其中的Accumulibacter ppk1基因含量偏低;有6个样品数量级为108，分别为H、B、C、I、J和K;样品A、E、G、F和L的数量级为109，这5个样品中的Accumulibacter的ppk1基因含量高于其他样品，其中样品L(A2O工艺)含量最高，达到了3.05×109 cells · g-1(以MLSS计).12个样品中Accumulibacter占总菌的百分比变化范围为0.58%~ 22.77%，平均为9.17%(图 1).
图1 Accumulibacter丰度及占总菌的比例
Mielczarek等(2013)通过FISH技术对丹麦28个城市污水处理厂中Accumulibacter进行研究时发现，Accumulibacter占总菌的平均比例为3.7%，低于本研究结果.而He等(2008)对5个污水处理厂中Accumulibacter占总菌比例的研究结果为9%~24%，与本研究结果基本一致.
从图 1中可以看出，样品A、E、F、G和L中Accumulibacter的丰度均在109 cells · g-1(以MLSS计)以上，而这5个样品中，L为A2O工艺、A为A2O+MBR工艺、E、F为A2O+NAR工艺，样品G为倒置A2O工艺，且在5个样品中丰度偏低.由此可见，A2O工艺及其改良工艺中Accumulibacter的丰度最高.且来自同一工艺的样品E和F证实了在A2O工艺的基础上加膜不会对Accumulibacter的丰度造成影响.同为氧化沟工艺的样品H和样品K中Accumulibacter的丰度在同一数量级上，为108 cells · g-1(以MLSS计).AO工艺的样品J中Accumulibacter的丰度和样品H(氧化沟)在同一数量级，和样品G同为倒置A2O工艺的样品I要比样品G小一个数量级.由此判断，倒置A2O工艺和氧化沟工艺的Accumulibacter丰度也处于比较高的水平，只有CASS工艺对应的样品中Accumulibacter丰度明显低于其他工艺.各个样品中Accumulibacter占总菌的比例与各个样品Accumulibacter的丰度变化趋势基本保持一致.
Accumulibacter 6个分支定量结果见图 2.6个分支在12个污泥样品中丰度变化范围及各分支占总Accumulibacter的变化范围见表 3.从图 2可以看出，Accumulibacter的6个分支中，IIC和IID处于同一数量级，为108 cells · g-1(以MLSS计)，分别占Accumulibacter总菌的比例为75.34%和14.87%，是污水处理系统中的优势菌属.尤其是IIC丰度达到了109 cells · g-1(以MLSS计). IIA、IIB和IIF处于同一数量级，为107cells · g-1(以MLSS计)，比IIC和IID低一个数量级，这3个分支之和占Accumulibacter 总菌的比例为9.34%.IA含量最少，数量级比IIC和IID低2个数量级，占Accumulibacter总菌的比例仅为0.32%.Accumulibacter的 6个分支均存在于每个工艺中，但Type I所占比例不到1%，而Type II接近100%.各个分支的变化基本和总Accumulibacter变化趋势一致，与Mielczarek等(2013)的研究结论一致，不同的是Mielczarek等没有发现任何处理厂含有Accumulibacter的5个分支(IA~IID). 本研究首次报道了IIC在9个城市污 水处理厂中丰度最高，IA在9个水厂中丰度最低，Accumulibacter的这种群落分布特点明显不同于其他污水处理厂.Type II中的6个分支在12个污泥样品中呈现不同的分布特点，定量结果证实了城市污水处理厂Accumulibacter进化枝水平分布的多样性.
图2 Accumulibacter各进化分支丰度及相对含量
表3 12个样品中C and idatus Accumulibacter中各进化分支的比例
3.2 12个活性污泥样品中C and idatus Accumulibacter 基于OTU的多样性分析
9个污水处理厂，共12个样品，构建12个ppk1基因克隆文库进行分析.12个克隆文库的Good 覆盖率、Chao1 丰富度估计、OTU 值与估计的 Chao1 值之比(OTUobserved/OTUestimated)、香农指数见表 4.12个污泥样品的ppk1基因的OTUs分布如图 3所示.如表 4所示，12个样品的Good覆盖率变化范围为71.43%~98.15%.计算的 OTU 值与估计的 Chao1 值之比除了样品A为47.06%，其余11个样品在62%~100%之间.Mehlig等(2013)对国外8个污水处理厂进行了研究，Good覆盖率只有35.4%~65.4%.说明本研究的12个克隆文库可以代表 12个样品中Accumulibacter的群落组成.样品A可能需要测更多的数据保证数据的可信度.
表 4同时给出了12个 ppk1 基因克隆文库中的香农指数，根据表中结果发现，样品C只有1个OTU，说明该样品中ppk1基因多样性很低，香农指数为零.另外11个样品的香农指数在0.15~2.04之间，其中，样品A、D、G、J和K含有较丰富的多样性.He等(2007)对9个市政污水处理厂中Accumulibacter的群落进行研究，香农指数在0.2~1.4之间.与本研究对12个克隆文库中Accumulibacter的群落多样性研究相符合.
表4 克隆文库中序列多样性及覆盖率
12 个ppk1基因克隆文库中共得到568 条 ppk1序列，按照 3% cut-off的距离划分为 29个 OTUs. 从图 3可以看出，样品C仅有1个OTU，意味着样品C中Accumulibacter的多样性最不丰富.而样品B和样品I分别包含3、2个OTUs，说明这2个样品中Accumulibacter的多样性水平比较低.样品A、D、G、J、H和K分别含有8、6、10、8、7和10个OTUs，具有较高的多样性水平，样品E、F和L均含有5个OTUs，较前6个样品多样性偏低.
OTU1共出现12次，即每个样品中都有序列出现在OTU1中，同时还是样品B、C、E、F、F、I和J共6个克隆文库中的优势OTUs.OTU3和OTU5在6个样品中出现，尤其在样品H的克隆文库中分布广泛.OTU7出现了4次.有4个OTUs共出现3次，分别为OTU2、OTU4、OTU6和OTU11.上述8个OTUs为Accumulibacter的主要种属.有10个OTUs(OTU10、OTU12、OTU13、OTU15、OTU17~ OTU20、OTU22、OTU23)出现2次，有11个(OTU9、OTU10、OTU14、OTU16、OTU21、OTU24~ OTU29)共出现1次，这21个OTUs中每个OTUs包含1~2条ppk1序列，不是Accumulibacter的主要种属.
图3 12个污泥样品的ppk基因的OTU分布图
3.3 12个活性污泥样品中C and idatus Accumulibacter基于系统发育树的多样性分析
利用29个OTUs的代表序列建立的系统发育树如图 4所示.He等(2007)对9个市政污水处理厂中Accumulibacter的群落进行分析认为，实际污水处理厂污水组成和运行情况比较复杂会导致污水中Accumulibacter种类比较丰富，所测得的序列至少分布在3个进化枝中.Type I包括IA、IB、IC进化枝，Type II包括IIA、IIB、IIC、IID、IIF进化枝.ID、IE、IIE和IIG在淡水和河口沉积物中发现，在此不做考虑.另外，序列Rhodocyclus tenuis 作为参考序列.以往的研究均是通过各个水厂中的代表序列建系统发育树，但本研究中采用各OTUs中代表序列建立系统发育树，这样更方便从整体上观察几个工艺中Accumulibacter的分布情况.如图 4所示，OTUs在几个进化枝间分布比较均匀，有27个OTUs属于Type II型的Accumulibacter，仅有2个OTUs(共12条序列)属于Type I型，说明实际污水除磷系统中的Accumulibacter主要以Type II型为主，与QPCR结果一致.
图4 基于ppk1基因的系统发育树
结合图 4和图 5可知，IIA包含6个OTUs(88条序列)，IIB包含3个OTUs(6条序列)，IIC包含11个OTUs(124条序列)，IID包含4个OTUs(315条序列)，IIF包含1个OTU(共23条序列).其中，优势OTUs(OTU1~OTU3)分别隶属于IID、IIC、IIA.QPCR和PCR-Cloning-Sequencing的研究结果都证实了12种污水处理工艺中Type I丰度很低，主要以 Type II为主，且IIA、IIC、IID是系统中的优势分支.
图5 12个污泥样品中Accumulibacter 6个分支分布图
3.4 C and idatus Accumulibacter各进化枝的分布与EBPR性能之间的关系
结合12个污泥样品的QPCR分析和克隆文库的分析可知，Type I和Type II均存在于城市污水处理厂中，以Type II为主，Type I占Accumulibacter总量的比例低于0.32%.Type II中以IIC为主，IID、IIA次之，IIB含量较不丰富，而IA丰度最小.这与实验室规模的反应器中Accumulibacter的种群结构明显不同，实验室反应器富集的Accumulibacter主要以IA和IIA为主(He et al., 2010;Gonzalez-Gil et al., 2011).对于污水处理厂中Accumulibacter各进化枝的分布与EBPR性能之间的关系分析如下：
1)除磷效果不好可能和IID占总Accumulibacter比例较高有关.本课题组前期对实验室规模的MUCT反应器中Accumulibacter种群进行反硝化除磷的研究，发现在以NO-2为电子受体的反硝化除磷系统中IID始终是优势菌属，占总Accumulibacter的90%以上(曾薇等，2013)，说明IID分支适合于以NO-2为电子受体进行缺氧吸磷.而实际污水处理厂是以O2为电子受体的好氧吸磷及以NO-3为电子受体的缺氧吸磷，IID比例的升高导致除磷效果变差.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
2)关于IIC在污水处理厂中的功能还需要进一步的研究.有报道称IIC可以利用硝酸盐为电子受体进行缺氧吸磷(Kim et al., 2013)，但也有报道称IIC是导致EBPR系统恶化的原因(Slater et al., 2010).由此可见，在系统发育上属于同一进化枝的Accumulibacter由于工艺和运行条件的不同可能会具有不同的功能.
4 结论
1)QPCR结果表明，Accumulibacter 6个进化枝(IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)存在于12个污泥样品中，占污水处理系统中总菌的比例平均为9.17%.A2O工艺及其改良工艺中总Accumulibacter丰度最高，占到总菌的22.8%，具有较好的生物除磷性能.分支IIC在11种工艺中均丰度最高，平均占总Accumulibacter比例的75.34%.IID次之，占总Accumulibacter的比例平均为14.87%，IA丰度最低，占总Accumulibacter比例平均只有0.32%.
2)12个活性污泥样品的系统发育分析也证实了Accumulibacter以Type II 为主，Type I少量存在.TypeII中以IIC、IID、IIA为主，IIB、IIF丰度偏低.
3)污水处理厂中Accumulibacter各进化枝的分布与EBPR性能之间存在一定关系.除磷效果不好可能和以亚硝酸盐为电子受体的IID占总Accumulibacter比例较高有关.而IIC在污水处理厂中的功能还需要进一步的研究.