1 引言
多氯联苯已被确定为“三致”物质，具有难降解性、生物毒性、生物蓄积性和远距离迁移性等，对人类生存繁衍和可持续发展构成严重威胁.我国已禁止多氯联苯的生产和使用，但早期使用及处置较为粗放，某些特定地区依然存在较为严重的土壤PCBs污染.
用生物处理法修复PCBs污染土壤操作简便、修复费用低，可彻底降解污染物，且不会产生二次污染.有研究报道，用Sinorhizobium meliloti菌株降解三氯联苯2，4，4′-TCB，6 d降解率达到77.4%(Tu et al., 2011);用Stenotrophomonas maltophilia菌株降解四氯联苯PCB52，7 d的降解率可达52.9%.但在受到PCBs污染的土壤中，常常有重金属污染同时存在，重金属对微生物降解PCB的生化过程有抑制作用.
本研究通过土著微生物筛选驯化，研究其对四氯联苯PCB77降解能力及影响因素，并分析其受重金属胁迫下的降解效率.
2 材料与方法
2.1 研究对象与菌株筛选
本文选择四氯联苯PCB77为研究对象，其化学名为3，3′，4，4′-Tetrachlorobiphenyl，化学结构见图 1.采用富集分离的培养方式，从长期受有机物污染的土壤中筛选获得1株能以PCB77为唯一碳源生长、具有较宽泛环境适应能力及较高降解效率的菌株，经16S rDNA鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas sp.)，命名为JXJ.利用联苯为底物驯化其降解PCB77的能力，并对其生长和不同条件下降解PCB77特性研究.
图1 PCB77化学结构式
2.1 主要仪器及试剂
实验所用标准品为PCB77(3，3′，4，4′-四氯联苯)(美国Accust and ard);正己烷为色谱纯级，其余试剂均为分析纯.主要涉及仪器有气相色谱-质谱仪(美国安捷伦)，智能精密摇床(上海博讯)、隔水式恒温培养箱(上海博讯)、洁净工作台(上海博讯)及灭菌锅(上海三申)等.
2.2 主要溶液及培养基
土壤初步驯化营养液由5 g葡萄糖、1 g磷酸二氢钾、2 g尿素、10 g联苯和10 L蒸馏水配制.
用5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g NaCl、1000 mL蒸馏水，在pH=7.0条件下配制富集培养基;固体培养基再加入15 g · L-1的琼脂，121 ℃灭菌30 min备用.
用0.5 g磷酸氢二钾、0.5 g磷酸二氢钾、1.0 g硫酸铵、0.2 g硫酸镁、0.1 g氯化钙、0.2 g氯化钠、1000 mL蒸馏水，在pH=7.0条件下配制无机盐培养基(MSM);固体培养基再加15 g · L-1的琼脂，121 ℃灭菌30 min备用.
2.3 多氯联苯降解菌的筛选及鉴定驯化
2.3.1 降解菌初步驯化、分离
采用规格为30 cm×30 cm ×20 cm的自制有机玻璃盒作为初步驯化装置，底层铺有高度约为2 cm的沙层，沙层上铺2 cm砾石，砾石层上铺有约8 cm取自某化工厂的有机污染土壤.定期加入含有联苯浓度为1000 mg · L-1的初步驯化营养液，定期翻动土壤，保持一定的土壤湿度，并控制土壤pH值在6.5～7.5之间，驯化1个月.取上述初步驯化过的土壤1 g，50 mL灭菌液体富集培养基，装入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1条件下振荡培养.待培养液发生浑浊时，在富集培养基上划线分离出单菌落.
2.3.2 降解菌强化驯化、分离
挑取上述分离出的单菌落，50 mL含有一定浓度PCB77的灭菌MSM，装入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1条件下振荡培养，每5～7 d转接1次，在相同条件下进行传代培养2个月，并不断提高MSM中的PCB77的浓度，驯化菌株对PCB77的降解能力.取驯化培养得到的菌悬液，在固体MSM上划线分离纯化，筛选出对PCB77有较高降解能力的菌株，将该降解菌株保存于试管斜面上，4 ℃冷藏保存.
2.3.3 降解菌鉴定及理化性质测定
菌株测序委托上海生物工程有限公司完成，得到该细菌的16S rDNA序列.登陆Genbank，通过Blast数据库进行同源性比较，利用MEGA5.0软件，选用邻接法(Neighbor Joining)，绘制该细菌的系统发育树.参考《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏系统细菌学手册》和相关文献进行形态和生理生化鉴定.
2.3.4 菌株的生长曲线测定
将纯化后的菌株分别接种在液体富集培养基、含有1000 mg · L-1联苯的MSM、含有1 mg · L-1 PCB77的MSM中，于30 ℃和150 r · min-1条件下培养，间隔一定时间取2 mL培养液，采用紫外-可见分光光度计(UVmini-1240，SHIMADZU)测定其在600 nm处的吸光度值，以此来表征培养液中菌体浓度.
2.4 高效降解菌降解率影响因素实验
2.4.1 菌液的制备
将驯化分离出的菌株接种于富集培养基中，在30 ℃、150 r · min-1条件下培养至对数生长期，以3500 r · min-1离心10 min，弃去上清液，用pH7.2的磷酸缓冲溶液洗涤沉淀物3次，重悬于相同培养基中，使最终OD600值约为1.0.
2.4.2 外加碳源对PCB77降解的影响
分别选取苯甲酸、邻苯二甲酸、联苯作为外加降解碳源.降解体系为装有20 mL MSM的50 mL三角瓶，其中PCB77浓度为均1 mg · L-1.第1组为对照，第2组为1000 mg · L-1的联苯，第3组为1000 mg · L-1的苯甲酸，第4组为1000 mg · L-1的邻苯二甲酸.在30 ℃、150 r · min-1条件下培养7 d，取样测定降解率.
2.4.3 体系pH对PCB77降解的影响
调节MSM的pH值，分别为3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9，接入2 mL(OD600=1.0)降解菌液，控制降解体系中PCB77浓度为1 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1条件下培养7 d，取样测定降解率.
2.4.4 PCB77初始浓度对降解的影响
在无菌条件下，准确移取一定量的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷挥发完全后，加入灭菌的MSM，并接入2 mL的菌悬液，使降解体系中PCB77的浓度分别为0、0.5、1.0、3.0、5.0 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1条件下培养7 d，取样测定降解率.
2.4.5 微生物接种量对PCB77降解的影响
在无菌条件下，用移液枪分别移取0.5、1.0、2.0、4.0 mL菌悬液于MSM中，在30 ℃、150 r · min-1条件下培养7 d，取样测定降解率，确定最适接种量.
2.4.6 重金属对菌体降解PCB77的影响
用铬和铅作为外加重金属，研究其对菌株降解PCB77的影响.在无菌条件下，准确移取2 mL浓度为10 mg · L-1的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷挥发完全后，添加一定量的重金属，并且接种菌液2 mL，使降解体系中重金属浓度分别为0 mg · L-1、0.1 mg · L-1、1 mg · L-1、5mg · L-1、10 mg · L-1、20 mg · L-1，PCB77浓度均为1 mg · L-1.在30 ℃、150 r · min-1的摇床上培养7 d，取样测定降解率.
以上降解率均指测定生长细胞对PCB77的降解率，接种2 mL对数生长期的菌悬液到20 mL不同降解体系中，测定7 d的降解率.每组实验设定3组平行，并计算误差.
2.4.7 PCB77的提取及测定方法
取20 mL正己烷加入降解体系中，超声辅助萃取10 min(王炳玲，2014)，转移混合液至分液漏斗中，待充分混合静置分层后，将上下相分离，萃取3次.合并3次萃取得到的正己烷，经无水硫酸钠脱水处理后旋蒸至3～5 mL，氮吹近干，定容至5 mL，漩涡震荡充分混合后，采用GC-MS测定，分析条件为30 m × 0.25 mm HP-5MS色谱柱，程序升温，离子源温度230 ℃，MS四级杆温度150 ℃，不分流进样，进样量1 μL(史永富等，2014).
3 结果与讨论
3.1 高效降解菌的生物学特性研究
3.1.1 菌株形态观察
通过富集、驯化培养的方法，从长期受有机污染的土壤中分离出1株多氯联苯降解菌，该菌株能以PCB77为唯一碳源进行生长，并对PCB77具有较高的降解能力.
观察可知，该菌株在无机盐固体平板培养基上具有以下特点：细胞呈圆形，直径约1 mm，不透明，菌落小，细胞表面光滑，边缘规则，接种初期为浅黄色，培养后产生绿色分泌物.在液体筛选培养基上有以下特点：整个培养液呈浑浊状，随着培养时间的增加，培养液颜色由透明的淡黄色，转变成绿色并变浑浊，最后变成棕红色.在光学显微镜下观察，细胞形态呈短杆状，经革兰氏染色，判断为阴性菌.
3.1.2 菌株生理生化指标测定
对JXJ菌株进行生理生化实验，结果见表 1.
表1 菌株JXJ部分生理生化测定结果
3.1.3 多氯联苯降解菌的鉴定
菌株的16S rDNA委托上海生工测定，获得的测序结果利用GenBank中的Blast软件进行序列相似性比较，结果显示菌株JXJ的16S rDNA序列与多种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有高度相似性，相似度达99%.在GenBank数据库中查找并下载与JXJ菌株基因有较高相似性菌种的16S rDNA片段，使用MEGA5.0软件，绘制JXJ菌株的系统发育树.从图 2可以初步判断，JXJ属于铜绿假单胞菌属.
图2 降解菌株JXJ的系统发育树
3.2 不同培养条件对菌株JXJ生长及降解PCB77的影响 3.2.1 菌株JXJ生长曲线
菌株JXJ在不同培养基中的生长情况如图 3所示.从图中可见，在相同培养条件下(30 ℃，150 r · min-1)，JXJ菌在富集培养基中长势最好，24 h达到对数生长期，此后微生物量略有下降，并保持相对稳定.由于联苯和PCB77都有一定生物毒性，在含有联苯和PCB77的MSM中，JXJ菌在不利的环境条件下，调整期明显延长(栗冬梅等，2012).经过约85 h后，JXJ菌快速生长，生长速率明显上升.
图3 不同培养基下菌株JXJ的生长曲线
3.2.2 外加碳源对PCB77降解率的影响
考察JXJ菌在3种不同外加碳源条件下，对浓度为1 mg · L-1的PCB77降解率的影响.如图 4所示，联苯和邻苯二甲酸的添加提高了JXJ菌对PCB77的降解率，而苯甲酸的加入对降解有一定的限制作用，其中联苯对降解促进作用最明显，7 d降解率达到了58.5%，其次是邻苯二甲酸，7 d降解率为53.8%，此时微生物利用外加的碳源，通过共代谢途径，提高了降解效率(李方卉等，2014).苯甲酸的加入，对JXJ菌降解PCB77有一定的限制作用，可能与苯甲酸在水溶液中呈酸性，改变了体系pH条件，使得JXJ菌不能处于最佳生长环境有关.实验结果运用单因素方差分析，在0.05的置信水平上，不同组间有显著差异，认为外加碳源的种类对微生物降解PCB77有显著影响.
图4 外加碳源对PCB77降解的影响
3.2.3 温度、pH对PCB77降解率的影响
不同种类的微生物，最适宜生长的pH、温度条件各不相同.培养体系pH的不同，会改变营养物质的生物可利用性和污染物的形态及生物毒性，从而影响微生物的活性，最终导致微生物生长速率和污染物降解速率的变化(熊士昌等，2012).从图 5a中可以看出，JXJ菌株可在pH值6.5~8范围内较快的生长，降解率保持在较高的水平，且在pH值为7.5时，7 d降解率高达49.3%，可见JXJ菌株适宜在中性或中性稍偏碱的条件下生长，过酸和过碱的条件会对其降解效果产生副作用.
图5 不同环境条件对PCB77降解的影响
微生物的生长，需要一定的环境温度条件.温度相对较低时，随着温度提升，微生物及其酶活性提高，降解率也随之增大;超过微生物最适温度后，温度的升高会导致微生物活性下降，甚至死亡，PCB77的降解率呈现显著下降.由图 5b可知，培养温度对JXJ菌株降解PCB77具有较为显著的影响，菌株可在较宽泛的温度区间降解PCB77，在25 ～ 40 ℃范围内均能保持较好的降解能力，其中最适温度为30 ℃.
3.2.4 PCB77
初始浓度对降解的影响 图 6所示为不同初始底物浓度对PCB77降解的影响.可以看出，初始底物浓度较小时，JXJ菌对PCB77有较高的7 d降解效率;当底物浓度从1 mg · L-1升高到5 mg · L-1，相应的降解率从49.3%下降到16.8%.这是由于高浓度的底物对微生物活性产生了抑制作用，影响到了酶促反应的进行，限制了微生物对污染物的降解(Cao et al., 2011).另一方面，当底物浓度从1 mg · L-1增加到2 mg · L-1时，降解量从9.86 μg提高到14.64 μg，因为低浓度时底物的生物毒性效应不明显，且底物浓度的增大，可提高底物被微生物利用的几率，从而提高降解量.继续增大底物浓度，PCB77的7 d降解量基本保持不变，这是因为碳源的增加对生物代谢的促进作用有限，且高浓度的底物对微生物活性有一定的限制作用.由此可以看出，微生物对PCB77有一定的降解能力，但通常较适用于低浓度污染，且降解过程较缓慢.
图6 PCB77初始浓度对降解的影响
3.2.5 接种量对PCB77降解的影响
微生物的初始接种量能够显著影响菌体生长.随着接菌量的增大，菌体可通过如种内协同作用，加快适应新环境，缩短调整期，利于菌体总量的增加，从而提高了微生物的降解效率.图 7是接菌量对PCB77降解的影响，随着接菌量的增大，降解体系中PCB77的残留率随之减小;接菌量为0.5 mL时，PCB77的7 d残留率为72.0%，是接菌量为4 mL时的1.67倍.
图7 微生物接种量对PCB77降解的影响
3.2.6 外加重金属对PCB77降解的影响
在添加铅和铬这两种污染土壤中常见的重金属后，JXJ菌对PCB77的7 d降解率出现了明显差异，在相同浓度条件下，重金属铬对JXJ菌的抑制作用明显强于铅(图 8).外加重金属浓度较低时，铬和铅对JXJ菌限制较小，JXJ菌依然能保持较高的7 d降解率，铅浓度为0.01 mg · L-1时，没有明显限制作用，当外加重金属浓度逐渐增加，JXJ菌降解率有大幅度下降.在铬浓度10 mg · L-1时的降解率约为0.01 mg · L-1时的一半;而同样条件下，外加铅时，降解率依然能够保持在原来降解率的68%左右.这是因为不同重金属离子对细菌生长抑制的毒性大小可能与细胞壁的亲和性有关，细菌细胞壁表面带有的负电荷，对带正电荷的金属离子有亲和作用，亲和性越强对微生物毒性越大(王秀丽等，2003;Xu et al., 2014).由此可以看出，在不同重金属存在时，其对JXJ菌的生长以及对污染物降解的影响是不同的，并且高浓度的重金属对JXJ菌均有一定的限制作用，因此JXJ菌适宜在污染物和重金属浓度较低的情况下，可用来降解污染物.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
图8 外加重金属对PCB77降解的影响
4 结论
1)从长期受有机物污染的土壤中驯化、筛选到1株能够以PCB77为唯一碳源生长的高效降解菌JXJ，革兰氏染色鉴定为阴性菌，经16S rDNA测序鉴定为铜绿假单胞菌.
2)菌株JXJ在30 ℃，pH为7.5，微生物接种量为2 mL(OD600=1)菌液，PCB77初始浓度为1.0 mg · L-1时PCB77 7 d的降解率为49.6%.
3)在不同碳源条件下，菌株JXJ的降解能力不同，联苯和邻苯二甲酸为外加碳源时，对降解有促进作用，且联苯效果优于邻苯二甲酸;外加相同浓度苯甲酸时，对JXJ的降解有一定限制作用.
4)菌株JXJ可耐受一定浓度的重金属，在低浓度外加重金属铬和铅的条件下，依然能保持较高的降解率，具有一定的实际修复应用前景.在高浓度外加重金属条件下，菌株生长受到明显抑制，降解率有大幅度下降，且铬较铅对菌株JXJ有更加明显的抑制作用.