1 引言
核磁共振(NMR)技术是现代科学中用途广泛的分析工具，它可以快速准确的用于土壤、动植物组织、沉积物等环境样品的分析，该技术检测尺度和使用范围较广.自然界中的磷仅有一种稳定同位素(31P)，其原子核质量数为奇数，原子核的自旋量子数为半整数，所以在外加磁场条件下可以产生核磁共振现象.虽然31P-NMR技术被应用于环境样品有机磷分析，但有机磷提取效率较低和核磁共振图谱质量不高等问题仍有待于进一步提高和完善.
有机磷是土壤及河湖沉积物的重要组成部分，在沼泽、土壤及湖泊沉积物中可以占到10%~90%.对有机磷的研究有助于人们深入认识磷的生物地球化学循环过程及其环境效应.传统的有机磷分析方法基于不同有机磷组分在酸碱提取液中的溶解性进行分离.这些方法虽然可以为认识磷在环境中的转化过程提供信息，但不能区分有机磷的组分及各组分在转化过程中的作用及影响因素，从而制约了人们对有机磷的深入研究.液相31P-NMR技术最低检出限较高，在进行分析前必须对环境样品的有机磷进行浓缩处理.而土壤样品具有复杂的物理化学性质，且含有铁锰等顺磁性离子，这些因素会影响核磁共振分析的效率.为了达到既能获得理想的有机磷提取效率，又可以降低提取液中的顺磁性离子(Fe3+、Mn2+等)干扰的目的，一些学者尝试用不同提取剂进行有机磷提取，主要包括NaOH(Ahlgren et al., 2005)、离子交换树脂(Adams and Byrne， 1989)、螯合剂+NaOH(Gressel et al., 1996)、NaOH+NaF(Sumann et al., 1998)、NaHCO3(Makarov et al., 2002)、BD(Reitzel et al., 2006)、H2SO4(Makarov et al., 2002)和EDTA+NaOH(Cade-Menun et al., 2000; Koopmans et al., 2007)等.在提取过程选择上包括一步提取和多步提取等(Bai et al., 2009; Zhang et al., 2009).以上提取剂最初被应用于土壤样品分析，而沉积物有机磷的提取和分析完全借鉴于土壤科学.目前仍然缺乏以高磷含量的河流沉积物为研究对象，进行有机磷核磁共振分析的研究.
本研究以磷污染较为严重的海河流域滏阳新河沉积物为研究对象，参照文献报道并结合目标沉积物理化特性，分别选择BD、EDTA、EDTA+Na2S2O4、 C4O6H4KNa·4H2O、Na2S·9H2O和NaOH为提取剂，采用两步提取的方式，利用液相31P-NMR技术系统评估不同提取剂和提取方式对沉积物样品总磷、有机磷、金属离子和核磁共振图谱质量的影响，以期在选择和优化理想沉积物有机磷提取剂和提取方式的基础上，探索沉积物有机磷的提取机理.本研究结果将为构建科学和普适的环境样品有机磷分析方法体系提供重要参考.
2 材料与方法
2.1 样品采集与处理
样品采集自海河流域滏阳新河，滏阳新河是子牙河水系的重要河流，开挖自20世纪60年代，主要用于分流滏阳河、醴河等的洪水.随着沿河社会经济的发展，大量污水进入滏阳新河，导致河水水质下降.自滏阳新河上游至下游共布设5个样点(1：37.500°N，115.058°E;2：37.681°N，115.665°E;3：37.827°N，115.862°E;4：37.930°N，115.967°E;5：38.117°N，116.075°E)，利用彼得逊采泥器采集表层约5 cm沉积物样品.将样品用密封自封袋保存，带回实验室利用冷冻干燥机冷干样品.剔除沉积物样品中的杂质后将5个样品均匀混合，四分法取部分样品研磨，研磨样品过筛用于试验分析.
2.2 沉积物物理化学性质分析
样品分析指标包括pH、有机质(OM)、总磷(TP)、有机磷(Po)、铁(Fe)、锰(Mn)、铝(Al)、钙(Ca)、镁(Mg).pH：去CO2水与过20目筛沉积物以2.5 ∶ 1的水土比混合后pH计测定(Bai et al., 2009);TP和Po：TP的提取，将沉积物样品置于马弗炉中500 ℃处理2 h，样品在干燥皿中放置常温后使用1 mol · L-1 HCl提取16 h，沉积物无机磷(Pi)直接利用1 mol · L-1 HCl提取16 h，采用钼酸盐比色法分别测定提取液中的TP和Pi，沉积物有机磷(Po)为总磷和无机磷的差值(Aspila et al., 1976);OM：采用烧蚀法测定，将去除水分的沉积物样品置于马弗炉中550 ℃处理4 h，灼烧前后的质量差值即为OM(Jensen et al., 1992);金属离子测定：沉积物样品取0.1 g过100目筛后利用微波消解仪消解(MARSXpress，CEM，USA)，消解液为HNO3-HCl-HF，样品消解完全后加1滴HClO4赶酸，利用ICP-OES/MS测定(USEPA，2007;Wen et al., 2012).
2.3 沉积物Po提取与液相31P-NMR分析
参照相关文献报道的基础上，分别利用BD、EDTA和Na2S · 9H2O等提取剂进行提取实验(表 1).提取剂分别选择BD(0.11 mol · L-1NaHCO3+0.11 mol · L-1Na2S2O4)，EDTA(50 mmol · L-1)，EDTA(50 mmol · L-1+Na2S2O4(2%，g/mL)，C4O6H4KNa·4H2O(0.1 mol · L-1)，Na2S · 9H2O(0.1 mol · L-1)，NaOH(0.25 mol · L-1).提取过程分为两步：分别称取6份等量(5 g)沉积物置于50 mL离心管，前5个样品分别依次加入前5种提取剂，提取比例为1 ∶ 10，室温、240 r · min-1下振荡2 h，振荡结束后将离心管置于冷冻离心机中4 ℃条件下8000 r · min-1离心30 min.过滤上清液用于TP、Po及金属离子检测，剩余沉积物与第6个样品一同加入0.25 mol · L-1 NaOH 溶液(浸提比例为1 ∶ 10)，室温、240 r · min-1下振荡16 h.振荡结束后置于冷冻离心机4 ℃条件下8000 r · min-1 离心30 min.过滤弃去沉积物残渣，过滤液部分用于TP、Po及金属离子检测，剩余提取液冷冻干燥待用.2次提取液稀释用于不同元素分析：TP测定需要首先利用过硫酸钾高温消解，提取液Po为TP和Pi的差值，TP和Pi含量采用化学分析仪测定含量(型号: SmartChem200;厂商：德国 AMS);金属离子利用ICP-OES/MS分析;剩余提取液冷冻干燥机冷干至粉末，冷藏待用.
表 1 沉积物有机磷提取剂及提取过程
液相31P-NMR磷最低检出限较高，为了保证不同提取液提取后核磁共振分析可以获得理想的图谱，用0.1 mL 10 mol · L-1NaOH+0.6 mL D2O的混合溶液溶解300 mg冷冻样品.混合溶液超声处理30 min，超声结束后静止平衡5 min，平衡结束后样品溶液14000 r · min-1离心15 min，上清液转移至核磁共振管检测.检测仪器为瑞士BRUKER公司生产的BRUKER AV400核磁共振仪.采用BRUKER标准腔5 mm的BBO探头，31P谱的脉冲P1=12.00 usec，脉冲功率PL1=3.00 dB，31P的共振频率为129.534 Hz，循环延迟dl=2 s，扫描20000次左右，测定温度为20 ℃.化学位移均参照85%的H3PO4，样品检测所得峰值参考已发表文献确定不同成分化学位移的组成(Turner et al., 2003; Cade-Menun.，2005)，对不同组分图谱进行积分，用于计算沉积物中不同组分有机磷的含量.
3 结果与讨论
3.1 沉积物物理化学特征
沉积物样品基本理化性质如表 2所示.点面源污染物排放的加剧增加了河流沉积物磷的累积，本研究样品沉积物总磷高达(4228.86±98.11)mg · kg-1，其中有机磷含量为(535.35±23.09)mg · kg-1，有机磷占到沉积物总磷的12.66%;沉积物OM值较高，为12.09%±1.18%.滏阳新河沿岸农田广布、人口密集、城镇化进程加快，产生了大量的工农业及生活污水，污水携带了大量污染物进入河流，导致河流沉积物有机质含量较高，这一现象在海河流域较为普遍(Qu and Kroeze， 2010; Pernet-Coudrier et al., 2012);沉积物pH为7.25±0.31，呈弱碱性;滏阳新河沉积物Fe、Al离子浓度高于Ca离子，Fe、Mn、Al、Ca、Mg的离子浓度分别为(57.59±1.23)、(0.63±0.11)、(27.12±2.76)、(14.15±2.87)和(3.90±0.66)g · kg-1，为典型的Fe/Al型沉积物.
表 2 河流沉积物理化性质
3.2 总磷(TP)和有机磷(Po)提取效率分析
不同提取剂前提取处理TP和Po的提取效率差异较大(图 1).EDTA +Na2S2O4提取的TP量最大为(1160.52±32.00)mg · kg-1，其次为 Na2S · 9H2O提取的TP量为(846.34±18.18)mg · kg-1，BD和C4O6H4KNa · 4H2O提取的TP量分别为(322.87±13.82)和(306.42±5.09)mg · kg-1，EDTA前提取液中的TP含量最低，为(119.76±16.00)mg · kg-1.不同提取剂前提取后NaOH提取沉积物样品所得到的TP浓度差别较大.与仅用NaOH一步提取相比，EDTA前提取后NaOH提取液中TP浓度较高，为(2477.40±112.72)mg · kg-1，BD和EDTA+Na2S2O4前提取后NaOH提取液中TP浓度分别为(2271.20±75.63)和(1909.71±31.27)mg · kg-1，与仅用NaOH提取相差不大，而其余两个处理C4O6H4KNa·4H2O和Na2S · 9H2O前提取后NaOH提取液中TP浓度低于仅用NaOH一步提取的结果.
图 1 不同提取液中TP和Po的含量
不同提取液处理对沉积物Po的提取效率差异明显.5种前提取液中以Na2S · 9H2O前提取Po的损失最严重，损失量为(68.82±1.74)mg · kg-1，其次为C4O6H4KNa · 4H2O前提取液中Po损失量为(46.36±5.81)mg · kg-1，其余3种提取液BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po损失量基本一致，分别为(24.91±15.24)、(20.90±2.58)和(21.69±5.16)mg · kg-1.前提取液对NaOH提取Po的效率亦产生影响.与仅用NaOH(Po：(185.05±40.12)mg · kg-1)一步提取相比，EDTA提取后NaOH提取液中Po含量较高，为(186.93±20.53)mg · kg-1，其余4种提取剂提取后NaOH提取液中Po浓度分别为(152.04±1.55)(BD)、(157.92±46.27)(EDTA+Na2S2O4)、(121.47±21.21)(C4O6H4KNa · 4H2O)、(99.87±15.20)mg · kg-1(Na2S · 9H2O).
综合来看，EDTA前处理显著增加了TP的提取效率，与仅用NaOH提取对比，TP的提取量增加了10%.这一研究结论与相关研究一致(Turner et al., 2005; Ahlgern et al., 2007).EDTA作为一种应用广泛的螯合剂，可以与沉积物中的金属离子(Fe、Al等)螯合形成络合物，从而促进了沉积物中铁铝结合态磷的释放，增加了提取液中TP的浓度(Cade-Menun and Preston， 1996; Cade-Menun and Lavkulich， 1997).BD处理也可以促进沉积物磷的释放，其机理与EDTA不同，BD可以使高价态金属离子还原为低价态金属离子，低价态金属离子对磷的吸附能力小于高价态离子从而促进磷的释放(Ahlgern et al., 2007).EDTA对沉积物中金属离子的螯合作用大于BD，因此，EDTA提取液中TP的浓度显著高于BD处理，且EDTA前提取液中TP的损失量小于BD.在本研究中，EDTA+Na2S2O4提取并没有增加TP的提取量，且前提取液中TP损失较大.C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O两种提取剂在TP提取上效果均较EDTA和BD差.Po的提取效率与TP类似.沉积物有机磷亦可以被Fe离子等金属离子结合，EDTA的存在螯合了金属离子从而促进了有机磷的释放(Turner et al., 2007).EDTA前处理在获得较高Po提取量的同时Po损失量最少，而BD和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po损失量较少，但NaOH提取液中Po的提取量也较小，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O两种提取剂对Po的提取效率低于其他处理.
3.3 金属离子提取效率分析
沉积物有机磷提取的最优效果是获得较理想的有机磷提取量和低浓度的顺磁性离子(Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ))，这些顺磁性离子的存在会提高弛豫时间，增加谱图的线宽使峰形重叠(Ding et al., 2010).不同提取剂Fe、Mn等5种离子的提取情况见图 2.就Fe离子而言，EDTA+Na2S2O4前处理对Fe离子的去除效率最高，提取液中Fe离子浓度为(106677.21±215.82)mg · kg-1.5种前处理中EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mn离子浓度高于其它3个处理，分别为(243.02±2.80)和(266.61±1.84)mg · kg-1.Na2S · 9H2O前提取液中Al离子浓度最高为(217.65±7.12)mg · kg-1.5种提取剂前提取后NaOH溶液提取液中Al离子的浓度EDTA+Na2S2O和EDTA处理较高为(718.95±5.25)和(687.73±3.53)mg · kg-1，其余3个处理NaOH提取液中Al离子浓度均低于前两个处理.EDTA和EDTA+Na2S2O4两处理前提取液中Ca离子浓度较高，分别为(22062.99±486.93)和(18729.74±26.93)mg · kg-1.BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mg离子浓度较高，分别为(273.06±1.24)、(238.32±8.37)和(333.68±0.36)mg · kg-1，其余两处理前提取液中Mg离子浓度较低.
图 2 不同提取液中Fe、Mn、Al、Mg、Ca离子浓度变化
不同提取剂对顺磁性离子的去除效率存在差异.EDTA是一种有效的络合剂，拥有6个配位原子，可以和金属离子形成稳定的水溶性络合物，EDTA提高有机磷提取量的同时结合Fe、Mn等顺磁性离子.在本研究中大量的Fe和Mn离子在EDTA提前提取中去除，从而减少了NaOH提取液中顺磁性离子的干扰;BD为0.11 mol · L-1 NaHCO3和0.11 mol · L-1 Na2S2O4的混合溶液，可以将金属离子从高价态还原成低价态从而促进磷的释放，在本研究中，BD对Fe、Mn等离子的提取效率均小于EDTA的提取效率;EDTA和Na2S2O4的混合溶液表现出了对Fe和Mn离子更高的去除效率，原因为EDTA和强还原性的Na2S2O4混合保证了金属离子的高去除率;而作为探索研究，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O对金属离子的去除效果较差，也没有较高的TP和Po提取效率.所以在对河流沉积物的有机磷提取中BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4对顺磁性离子的去除效果较为理想.
3.4 沉积物有机磷提取图谱分析
利用液相31P-NMR对NaOH提取液进行分析得到5种磷组分，分别是正磷酸盐(Ortho-P: 6~7 ppm)、焦磷酸盐(Pyro-P：-3.5~-4.5 ppm)、磷酸单酯(Mono-P：4~6 ppm)、磷脂(Lipids-P：1~ 3 ppm)和DNA-P(DNA-P：0~-1 ppm)(图 3).从图谱分析可以看出，提取剂对沉积物磷形态并没有产生影响，提取剂前提取后，均可以得到5种磷形态. 不同提取剂对沉积物中不同磷形态含量造成的影响存在差异.EDTA和BD处理后显著提高了沉积物NaOH提取液中Pi的提取量.EDTA处理后提高了沉积物NaOH提取液中焦磷酸的量;5种提取剂处理后并没有提高磷酸单酯的量.EDTA、EDTA+Na2S2O4和C4O6H4KNa · 4H2O 3个处理显著提高了磷脂的含量，分别由0.63 mg · kg-1增加到3.44、2.58和4.09 mg · kg-1;对DNA-P而言，仅EDTA处理提高了其含量(表 3).
图 3 河流沉积物有机磷核磁共振磷化合物图谱
表 3 液相31P-NMR检测的河流表层沉积物不同形态磷含量
4 结论与展望
1)从TP和Po的提取效率来看，BD和EDTA前处理能提高TP的提取效率，而且前提取液中TP的损失量较小.5种提取剂前处理Po的损失量差别不大，EDTA处理可以提高Po的提取量.综合TP和Po来看，EDTA前处理既可以提高TP和Po的提取效率，又能保证TP和Po在前提取液中的损失量较小;核磁共振图谱分析显示，EDTA可以提高沉积物中正磷酸盐、焦磷酸盐、磷脂和DNA的含量.
2)不同的提取剂对顺磁性离子Fe和Mn提取效率差异较大：与仅用NaOH提取相比，几种提取剂前提取后对NaOH提取液中Fe离子的影响不显著，但BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以去除大量Fe离子，从而降低沉积物中Fe离子的含量;对Mn离子而言，EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以降低沉积物中Mn离子含量，保证了NaOH提取液中Mn离子含量低于仅用NaOH提取.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
3)综合以上3个主要指标可以得到，对于总磷和有机磷含量均较高的河流沉积物样品，在进行有机磷提取分析时，采用两步提取方法，即首先利用50 mmol · L-1 EDTA进行前提取后利用0.25 mol · L-1 NaOH提取可以保证较理想的Po提取效率和核磁共振图谱、较低的顺磁性离子干扰，从而保证沉积物有机磷液相31P-NMR分析的科学性和有效性.
本研究基于河流沉积物样品探究了5种常用提取剂的提取效果，取得了较为理想的结果.与目前使用范围较广的提取剂配比(0.25 mol · L-1 NaOH+50 mmol · L-1 EDTA)相比，本研究在探索不同提取剂提取机理和优选更适用的提取剂方面具有科学意义，而且作者利用本文优化的提取方法对海河流域其他河流进行有机磷提取分析，均取得了较好的效果(未发表数据).因此，本方法完全可以应用于高磷含量的河流沉积物有机磷分析.环境样品理化性质千差万别，要想获得较为理想的提取剂必须针对不同环境样品进行大量的实验，以验证提取剂和提取方法的普适性.目前，我国河湖富营养化问题突出，在对水-沉积物界面磷的生物地球化学循环过程及影响因素等问题上仍需深入探讨，而核磁共振技术可以为此提供有力的技术支持.基于以上考虑，将来可以加大提取剂的选择范围和扩大环境样品类型，以选择理想的有机磷提取剂，优化有机磷提取方法体系.