1 引言
共凝集是无亲缘关系的细菌通过细胞表面分子进行特异性识别进而凝集在一起的行为，能够特异性地增强配对微生物进入生物膜的机会.所谓架桥细菌(Bridge bacterium)，即是一类具有广泛共凝集能力的细菌，它能与多种属的细菌同时发生较强程度的共凝集，在多菌种生物膜形成中起到核心或桥梁作用.架桥细菌的发现与研究最早出现在医学领域(富饶等，2005;郭彤等，2004)，随之在天然水体或污水处理等水环境领域里也陆续分离得到诸如藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(Paster et al., 2001)、约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii s35)(Malik et al., 2003)和醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter cacoaceticusl)(Simes et al., 2008)等为数不多的架桥细菌.
生物膜是多种微生物细胞以主动附着、吸附、凝集等方式固定于载体表面的复杂微生物群落(Sutherland et al., 2001)，这种自然固定化的微生物可在一定程度上通过基因表达谱的简单变化来适应其它微生物种属的存在，形成亲密的或特殊的关系，从而衍生出稳定性和适应性更强的微生物群落(Mah et al., 2001;2003).Di Gioia 等(2004)研究发现，无降解能力但有共凝集能力的Bacillus sp. VA160与2株具有壬基酚聚氧乙烯醚降解能力的菌株Acinetobacter sp. BCaL1和Stenothrophomonas sp. BCaL2共培养，2种细菌间凝集体的形成促进了复杂有机物的降解.国内也有报道发现，2株成膜力强的细菌与降解菌混合培养明显增加了生物膜中降解菌的数量(Li et al., 2009;2008).
污水处理中常因降解菌的流失或不易定殖而无法长期维持稳定的降解效果，这一问题始终困扰着生物强化技术的应用和推广.本课题组从多种废水处理系统的生物膜中筛选出一株有广泛共凝集能力且具有架桥作用的细菌—Bacillus cereus G5(杜青珍等，2010)，初步研究发现，G5可与6个属的15株不同细菌发生较强程度的共凝集，并明显促进了生物膜量的增加，显示出G5作为架桥细菌在促进降解菌定殖上的应用潜力.基于此，本研究检测了G5与来源于同一批活性污泥中的13株土著菌和实验室已有的3株降解菌混合后的共凝集能力、生物膜形成能力及废水处理效果的持久性，通过对架桥细菌能否以生物自固定化机制促进降解菌定殖于生物膜的研究，探索生物强化处理中促进降解菌定殖的新思路.
2 材料与方法
2.1 材料
活性污泥取自苏州市娄江污水处理厂曝气池.3，5-二硝基苯甲酸降解菌Comamonas testosteroni A3(李蒙英等，2007)、苯酚降解菌Pseudomonas P1、甲基对硫磷降解菌Pseudomonas putid DLL-1(刘智等，1999)及架桥细菌Bacillus cereus G5均为苏州大学环境微生物实验室保藏.
Luria-Bertani(LB)液体培养基：Tryptone 10 g · L-1，Yeast Extract 5 g · L-1，NaCl 10 g · L-1，pH 7.0~7.4.LB固体培养基在此基础上另外添加1.5%~2.0%琼脂.10%LB、5%LB则按比例稀释.
2.2 实验方法 2.2.1 土著菌分离
将采集的活性污泥放入无菌三角瓶中振荡，用无菌生理盐水系列稀释后涂布于LB、稀释10倍的LB(10%LB)、稀释20倍的LB(5%LB)固体培养基平板进行分离培养，挑取单菌落，经反复纯化后的菌株分别于4 ℃和-80 ℃保藏备用.
2.2.2 菌悬液制备
分别将G5、降解菌及从活性污泥中分离得到的土著菌活化后接种于LB液体培养基，30 ℃、180 r · min-1振荡培养20 h，5000 r · min-1离心5 min收集菌体，以0.1 mol · L-1、pH=7.0的PBS缓冲液洗涤2次后重悬，调菌悬液OD660至1.0左右备用.
2.2.3 共凝集率检测
取制备好的2株配对细菌的菌悬液各5 mL，加入到15 mL无菌离心管，漩涡混均，室温静置孵育，分别于2 h和20 h时在500 r · min-1条件下离心1 min，660 nm下测上清液吸光值OD660(x+y);两配对细菌的菌悬液各取10 mL，分别静置孵育，以相同方法测上清液吸光值OD660x和OD660y，计算共凝集率R(Shen et al., 2005)：
式中，OD660(x+y)为某一组合中两配对菌株的菌悬液混合孵育后的吸光值，OD660x和OD660y为两配对菌株的菌悬液单独孵育后的吸光值.
2.2.4 成膜能力测定
采用结晶紫染色法(Zhu et al., 2003)测定生物膜量.将菌悬液按1%(V/V)接种量分别接种两配对菌于装有已灭菌的2 mL LB、10% LB、5%LB的玻璃试管中，30 ℃、180 r · min-1下振荡培养24 h，轻轻倒去培养液，用去离子水洗去生物膜表面浮游细菌;加入0.1%结晶紫水溶液2 mL，室温染色30 min，倒出染色液用去离子水轻轻洗涤2次;自然干燥后，加乙醇/丙酮溶液(80 ∶ 20，V/V)2 mL，洗脱吸附于生物膜上的染料，乙醇/丙酮溶液适当稀释后测570 nm处的吸光值，计算生物膜量.
2.2.5 凝集体观察
采用电子显微镜观察凝集体中菌体的组成和分布.
2.3 序批式生物膜反应器 2.3.1 实验装置与方法
装置由有机玻璃板制成，尺寸为22 cm×14 cm×16 cm(长×宽×高)，有效水深14 cm，有效容积5 L.内部填充半软性纤维复合填料与聚乙烯多孔球形悬浮填料，约占反应器有效容积的30%左右，通过气泵及曝气砂头进行曝气.不同反应器设置方案如表 1所示.
表1 3，5-DNBA反应器设置
2.3.2 工艺运行
反应器接种后闷曝24 h，换水2.5 L，之后每12 h换水2.5 L作为一个周期，继续挂膜培养2 d.第4 d排空反应器，加入新鲜废水，反应器设置为：进水0.5 h，曝气22 h，闲置1 h，排水0.5 h，每天换水2.5 L，运行温度(26±2)℃.定时取样测定出水水质.
苯甲酸合成废水M1成分(mg · L-1)：NH4NO3 400，KH2PO4 100，K2HPO4 30，MgSO4 200，NaCl 30，酵母粉100，葡萄糖 200，3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)100~1000，pH= 7.0.
CODCr采用重铬酸钾法测定(国家环保总局《水和废水监测分析方法》编委会，2002);TOC采用总有机碳分析仪(岛津TOC-4200)检测;3，5-二硝基苯甲酸含量采用分光光度计法测定(李蒙英，2007);生物膜量采用称重法测定.
3 结果与讨论
3.1 架桥细菌与土著菌和降解菌的共凝集
从采集的活性污泥中分离得到13株细菌，分别命名为L2、L7、L7R、L8、L15、L25、L31、L47、L48、L51、L61、LF3、LH1，连同已有的3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3、苯酚降解菌P1和甲基对硫磷降解菌DLL-1，分别与G5配对，对其共凝集能力进行了测定，结果如图 1所示.由图 1可知，G5与16株细菌配对组合的共凝集率在2 h时达到40%~70%，能与56%(9株)的细菌发生共凝集率大于50%的共凝集反应;20 h时，共凝集率可达55%~80%，同时能与高达93%(15株)的细菌发生共凝集率大于50%的共凝集反应.值得注意的是，G5与3种降解菌在20 h时的共凝集率分别可达到77.7%、59.1%和68.3%，表明在废水处理系统外G5能与土著菌和降解菌发生较强程度的共凝集.
图 1 G5与土著菌、降解菌混合培养不同时段的共凝集率
G5与3株降解菌孵育20 h时的凝集体见图 2.G5菌体细胞显著大于3株降解菌，从电镜照片中可清晰观测到G5分别与3株配对菌黏联在一起，形成共凝集体，同时G5和降解菌自身也有自凝集现象，表明G5通过共凝集和自凝集形成了较大的菌团.
图 2 G5与3株降解菌孵育20h时的凝集体
3.2 架桥细菌与土著菌和降解菌混合培养时的成膜能力
在营养浓度高的LB培养液中，有93%(15/16)的细菌与G5混合培养时的生物膜形成量(以OD570表征)高于单菌培养的生物膜形成量，其中11株的成膜能力超过1.5(图 3a).在营养浓度较高的10%LB培养液中，88%(14/16)的细菌与G5混合培养时的生物膜形成量高于单菌培养的生物膜形成量，仅有8株成膜能力超过1.0(图 3b).在营养浓度较低的5%LB培养液中，虽然仍旧有高达93%的细菌与G5混合培养时的生物膜形成量高于单菌培养的生物膜量，但成膜能力普遍很低，平均只有0.6(图 3c).
图 3 不同培养基中G5与配对菌单独培养及混合培养24 h时的生物膜形成量(a.LB，b. 10%LB，c. 5%LB)
无论单独培养还是混合培养，生物膜量均随着营养浓度的降低而减少.同时，G5与16株细菌中的大多数细菌混合培养时均增加了生物膜形成量，表现出促进生物膜形成的能力.由此可见，G5不仅具有广泛的共凝集能力，还具有很强的成膜能力.SPSS分析结果显示，G5与16株细菌的共凝集率与其成膜量呈显著正相关，相关系数达0.896(p<0.01).如图 1、图 3所示，G5与3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3的共凝集率为62.4%，混合培养时的成膜能力可达2.5;与苯酚降解菌P1的共凝集率为60.0%，成膜能力为1.8.
3.3 序批式生物膜反应器(SBBR)运行结果 3.3.1 反应器的启动挂膜
由图 4a可知，反应器启动时3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)初始浓度为100 mg · L-1.曝气过程中活性污泥随气体悬浮并很快附着到填料上.闷曝24 h后，投加降解菌A3的2号和3号反应器出水中3，5-DNBA含量分别下降至19.1 mg · L-1和10.1 mg · L-1，而未投加降解菌的对照组1号反应器为89.3 mg · L-1，表明投加降解菌的2个反应器能快速降解3，5-DNBA.第2 d，对照组1号反应器出水中3，5-DNBA含量降至3.6 mg · L-1，说明来自污水处理厂活性污泥中的混合菌群也对3，5-DNBA进行了降解.
3.3.2 反应器的长期运行
第4 d排空反应器，以填料上快速形成的生物膜进行废水处理，运行24 h时，1、2号和3号反应器出水中3，5-DNBA含量分别降至37.6、7.4和7.3 mg · L-1(图 4a).表明排空污泥后，2号和3号反应器中生物膜对底物具有快速降解能力，明显高于未投加降解菌A3的1号反应器.
图 4 反应器出水中3，5-二硝基苯甲酸、COD和TOC含量
运行至第13 d，提高进水中的3，5-DNBA至200 mg · L-1，14 d时对照组1号反应器与只投加了A3菌的2号反应器出水3，5-DNBA含量由13 d时的20.2 mg · L-1和20.4 mg · L-1分别升至111.7 mg · L-1和107.1 mg · L-1;保持此负荷运行1周后，两个反应器出水3，5-DNBA含量均稳定在110~120 mg · L-1之间，3，5-DNBA平均降解率分别为34.7%和43.0%，与最初2周的去除率相比有较大幅度下降，表明进水3，5-DNBA浓度的增加使其受到较大冲击.而在投加A3和G5的3号反应器，14 d时出水3，5-DNBA含量仅为3.0 mg · L-1，3，5-DNBA平均降解率为74.1%，说明进水负荷的加大对反应器的冲击较小，保持了稳定的生物强化效果.
由于3个反应器中底物均可较快速的降解，运行后期快速提升底物负荷，30 d时3.5-DNBA含量达1000 mg · L-1.1号与2号反应器出水中3，5-DNBA含量出现小幅增加，但降解率仍呈现交替上升，最终分别为87.9%和88.1%，两者降解能力相差不大.3号反应器降解率只出现轻微波动，经过短暂调整后3，5-DNBA降解率最终达到88.1%，运行过程中降解率和稳定性总体上高于1号和2号反应器.3个反应器对COD、TOC的去除效果表现出与3，5-DNBA相似的变化趋势(图 4b、4c).
从活性污泥中分离获得的土著菌均不能单独降解3，5-DNBA，反应器运行结果显示，未添加降解菌的1号反应器也能较好地降解3，5-DNBA，推测污泥中的混合菌群可能通过共代谢、协同作用等方式使复杂有机物3，5-DNBA得到了降解.2号反应器24 h内对3，5-DNBA的快速降解则体现了降解菌A3本身良好的生物强化效果.投加混合菌剂的3号反应器保持了较稳定的3，5-DNBA降解能力，一定程度上说明G5促进了A3在生物膜中的定殖和生长，从而能够长期维持良好的降解效果和较强的抗冲击负荷能力.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
3.3.3 生物膜量
图 5显示了运行前、中、后期3个反应器内生物膜量的变化.由图可知，运行前20 d，1号和2号反应器内生物膜量呈增长趋势，运行后期膜量下降，表明有一定的脱落.投加混合菌种的3号反应器内，运行后期生物膜量仍保持增长，其并未因冲刷引起膜量过多脱落而导致减少.
图 5 反应器运行过程中生物膜量
4 结论
1)G5与13株土著菌和3株降解菌两两配对组合的共凝集率结果显示，孵育2 h和20 h时，G5分别能与9株(占总测定菌株的56%)和15株(占总测定菌株的93%)细菌发生共凝集率大于50%的共凝集，共凝集率可达40%~70%和55%~80%，表现出广泛的共凝集能力.
2)不同营养条件下，90%配对菌与G5混合培养的生物膜形成量高于单菌培养，表现出明显的促进生物膜形成的能力.
3)同时投加降解菌A3与架桥细菌G5的序批式反应器表现出快速的生物强化作用和较强的抗冲击能力，并保持了较高的生物膜量，说明在废水处理系统内，Bacillus cereus G5亦可能通过其广泛的共凝集能力促进生物膜的形成，并辅助降解菌以自固定化方式定殖于生物膜中.