1 引言
氨氧化过程是硝化反应的第一步，也是氨氮去除的限速步骤，在以往的研究中认为氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)是氨氧化过程中的唯一贡献者，新近研究发现氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea，AOA)也是氨氧化过程的一个重要参与者，且已在海洋、自然湿地、温泉中检测到了氨氧化古菌的大量存在.氨氧化古菌的出现促使人们更新了对氮循环的认识.近几年来，地表水受点源与面源污染的影响，使很多水源地水质呈现微污染状态，其中氨氮是主要污染物之一.人工湿地是一种对氮、磷污染物去除率高、处理工艺简单、生态修复能力强的处理系统，是解决水源地微污染问题的有效途径.目前，很多专家致力于对人工湿地中氨氧化微生物的研究，Wang和Gu(2013)发现在低氨氮环境中人工湿地中氨氧化古菌丰度及生物多样性要高于自然湿地.且很多研究表明氨氧化细菌在低温条件下生长会受到明显抑制，而氨氧化古菌具有较高丰度，比氨氧化细菌更具有竞争力.国内对人工湿地的研究已有大量报道，而对低温条件下湿地系统中的微生物特性报道较少.因此，研究人工湿地在低温环境下微生物作用机制及提高湿地系统对氨氮的处理效率具有重要意义.
本文针对寒冷冬季北方氨氮微污染水体的特征，构建间歇流人工湿地系统在低温条件下运行，研究不同运行条件下对氨氮的去除效率，并运用分子生物技术对各运行条件下氨氧化古菌和氨氧化细菌进行定性定量分析，同时对湿地系统中氨氧化微生物的比细胞速率和土壤的硝化速率潜势进行考察，并对夏季和冬季样品中的氨氧化古菌的生物多样性季节性变化进行讨论，以期为提高在低温条件下湿地系统对氨氮的去除效率提供理论依据.
2 材料和方法
2.1 人工湿地系统构建
构建容积为0.5 m3(宽0.5 m×长1 m ×高1 m)的垂直流人工湿地4块(如图 1)，均在底部铺设20 cm的碎石(直径1~3 cm)，上层0~20 cm和50~80 cm铺设混合土壤，其中混合土壤包含45%的粘土，25%的沙土和30%的黑土.为了增加湿地中的微生物量，在距表层30~50 cm填埋污水处理厂活性污泥，活性污泥取自北京市某城市污水活性污泥处理厂的好氧池泥水混合液，填料区总容积为0.45 m3.湿地平均孔隙率20%，含水率为18.2%，土壤容重为1.36 g · cm-3. 在湿地表层、-50 cm和底层 -70 cm处采用穿孔管均匀布水.湿地种植芦苇，种植密度为16 株· m-2.
图 1 湿地构建图
本实验采用中国科学院生态环境研究中心园区污水处理站中水，进水指标见表 1.
表1 进水水质
人工湿地进水与出水均采用蠕动泵精确控制，人工湿地自6月开始运行，夏季运行时，采用表层布管进水;冬季平均气温为5 ℃时，采用表层布水管进水;平均气温为-5 ℃时，由于湿地所在地区冻土深度小于50 cm，为防止表层进水结冰，采用中间布管均匀进水，出水均由蠕动泵由-70 cm处布水管抽出，考察在不同的水力负荷和停留时间下湿地的氨氮去除效率.每改变一次运行条件，连续运行一周后开始取水样，以保证出水稳定，出水氨氮由出水管取样检测，每改变一次运行条件，运行34 d后用土钻获取湿地-50 cm处土壤样品，取出后迅速保存于-4 ℃冰箱，取一部分土壤样品在24 h之内测定湿地土壤硝化反应潜势，另一部分采用冷冻干燥机(博医康实验仪器公司，北京)冻干，保存于-80 ℃待提取DNA.运用分子生物学技术对湿地氨氧化古菌、细菌丰度及古菌生物多样性进行分析.
2.2 样品理化指标分析
试验检测的主要水质指标测定方法如下：NH+4-N采用靛酚蓝比色法，NO-3-N采用紫外分光光度法，NO-2-N采用N-(1- 萘基)-乙二胺光度法，COD采用分光光度法，TP采用过硫酸钾消解-紫外分光光度法，pH采用PB-10型数显pH计检测.
2.3 DNA提取和聚合酶链式反应(PCR)
利用Fast Soil DNA提取试剂盒(Qbiogene，Carlsbad，CA)，从约0.33 g冻干土壤样品中提取土壤中的总DNA，所得土壤DNA于-20 ℃保存待用.氨氧化古菌扩增采用amoA功能基因的特异引物，分别为archaea-amoAF/archaea-amoAR.PCR反应体系为50 μL，其中，10×buffer 5 μL，2.5 mol · L-1 dNTP 4 μL，10 mmol · L-1 正反向引物各1 μL，BSA 0.25 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O补足至50 μL.PCR扩增程序由以下3步构成：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环;75 ℃延伸15 min.
2.4 克隆文库构建和序列分析
PCR扩增产物用Promega Agarose Gel DNA(Promega，Madison，WI)纯化试剂盒进行切胶纯化，回收的PCR产物与pGEM-Teasy载体(Promega，Madison，WI)连接，转入JM109(TaKaRa)感受态细胞，最后进行蓝白斑筛选.对选取的96 个白色克隆进行PCR扩增，以鉴定阳性克隆，所用引物为载体通用引物T7、SP6.用限制性内切酶Hha I对阳性克隆PCR扩增产物进行酶切分型，每个酶切类型挑取代表菌株进行测序(Tsingke生物技术有限公司，北京).返回序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，并搜索相似序列，并与已发表的相关古菌的amoA 功能基因序列进行多重序列比对，使用MEGA4.1软件以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树.独立操作单元OTU利用DOTUR软件按97%的相似度进行划分，并计算生物丰富度和多样性指数.
2.5 AOA和AOB丰度测定
采用实时荧光定量PCR方法分别对AOA、AOB进行定量分析，其定量PCR均采用SYBR Green法.AOA定量所用引物参见AOA普通PCR扩增，AOB定量选用amoA功能基因特异引物amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′).扩增体系为20 μL，其中，SYBRs Premix Ex Taq酶(TAKARA，大连)10 μL，ROX50 0.4 μL，浓度为200 nmol · L-1 的AOA、AOB正反向引物各0.2 μL，稀释10倍的DNA模板2 μL，用ddH2O补足至20 μL.采用ABI 7300 Real-Time PCR System扩增仪(Applied Biosystems，CA，USA)进行定量，AOA定量PCR扩增程序如下：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环;72 ℃延伸1 min.AOB定量PCR扩增程序如下：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环;72 ℃延伸1 min.实验设置阴性对照，并将已知拷贝数的质粒DNA梯度稀释(10倍)，得到6个标准样品同样进行定量扩增，得到标准曲线，每个样品做3次平行.要求结果扩增效率大于95%，可决系数R2大于0.98，溶解曲线为单一峰.
2.6 硝化速率潜势(PNR)测定
硝化速率潜势(Potential Nitrification Rate，PNR)测定(以N计)参照Kurola等(2005)的氯酸盐抑制法，向50 mL离心管中加入3.0 g新鲜土壤样品和20 mL磷酸盐缓冲溶液(NaCl 8.0 g · L-1，KCl 0.2 g · L-1，Na2HPO4 0.2 g · L-1，NaH2PO4 0.2 g · L-1，pH=7.4)，以及1 mmol · L-1(NH4)2SO4.另外，加入氯酸钾至终浓度为10 mg · L-1以抑制亚硝酸盐氧化.溶液混匀后在室温下避光培养24 h，加入2 mol · L-1的KCl 5 mL浸提亚硝酸盐，离心后取上清液用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法在540 nm处测定亚硝酸盐浓度.亚硝酸盐累积速率即为硝化速率潜势.所有样品设置3个重复.
3 结果
3.1 不同水力负荷下人工湿地的运行情况
夏季运行时，人工湿地采用停留时间48 h，水力负荷4.2 cm · d-1运行，氨氮去除效率达98%~99%，稳定运行2个月后取土壤样品提取DNA，对氨氧化古菌和氨氧化细菌中amoA基因进行定量.
继进入冬季后平均气温降为5 ℃，采用停留时间为21 h，不同水力负荷(4.2 cm · d-1，4.8 cm · d-1，5.4 cm · d-1，6 cm · d-1)运行，平均每6 d取1次水样对氨氮浓度进行检测，各人工湿地氨氮去除率都达到98%以上(如图 2).在人工湿地运行34 d后取土壤样品提取DNA，采用实时荧光定量PCR技术对氨氧化古菌和氨氧化细菌中amoA基因丰度进行定量分析.在不同水力负荷条件下，各湿地中古菌和细菌中的 amoA基因丰度值同冬季低温运行前夏季样品相比都发生了变化.在水力负荷为4.2 cm · d-1和4.8 cm · d-1时，冬季样品古菌(AOA)amoA基因的丰度均高于冬季前样品，且在水力负荷为4.2cm · d-1时，古菌amoA基因丰度最高，与冬季前样品相比增长了5.24倍;而细菌(AOB)amoA基因丰度在水力负荷为4.8 cm · d-1、5.4 cm · d-1时运行后丰度高于运行前，且在水力负荷为4.8 cm · d-1时，细菌(AOB)amoA基因丰度最高，与冬季运行前样品相比增长了6.50倍.
图 2 不同水力负荷下湿地中AOA、AOB中amoA基因丰度及PNR(图中数值为冬季5 ℃与冬季前AOA和AOB比值)
本研究还对土壤的硝化速率潜势进行了测定，当AOA丰度达到最高值8.87×109 copies · g-1，PNR 也为最高值16.01 nmol · g-1 · h-1(以N计)，PNR的变化趋势和AOA丰度呈正相关，且AOA高于AOB的amoA基因丰度的6.6~33.2倍，这说明在低温条件下，AOA对氨态氮的氧化具有较高的竞争优势.
3.2 不同停留时间人工湿地的运行
在运行平均气温降为-5 ℃时，采用水力负荷为3.6 cm · d-1，不同停留时间(21 h、18 h、12 h)运行，随着温度降低，人工湿地对氨氮的去除率呈下降趋势，停留时间为21 h时，平均去除率最高达81%，停留时间缩短，氨氮去除率也明显下降，当停留时间为18 h、12 h时，去除率分别为71%、46%.可以得出，在低温条件下较长的停留时间有利于氨氮的去除.由图 3可知，氨氧化古菌和氨氧化细菌中amoA基因丰度随温度降低而减少，但古菌AOA丰度仍高于细菌AOB丰度 2.9~32.8倍.土壤中的硝化速率潜势没有降低，在停留时间18 h时最低，为10.8 nmol · g-1 · h-1(以N计)，停留时间最短12 h时最高，为14.6 nmol · g-1 · h-1(以N计)，且PNR与AOA丰度及AOA/AOB的比值都呈正向变化趋势.
图 3 不同停留时间湿地系统中AOA、AOB中amoA基因丰度及PNR(图中数值-5 ℃运行前与-5 ℃运行后AOA、AOB比值)
3.3 人工湿地系统中AOA的多样性
为研究人工湿地中古菌AOA的生物多样性季节性变化，取夏季土壤样品和冬季平均气温为-5 ℃运行时土壤样品提取DNA，进行特异性扩增，得到片段长度约为636 bp的AOA扩增产物，进行克隆，每个样品进行随机挑取96个克隆子，对其阳性进行酶切，夏季样品得到11种酶切类型，冬季样品得到15种酶切类型，每种类型挑取一个样品，进行测序，通过OTU计算，将相似性为97%以上的序列分为1个OTU，湿地系统中氨氧化古菌生物多样性情况如表 2所示.夏季样品与冬季样品序列放在一起计算OTU，共得到21个OTU，其中夏季样品分为8个OTU，冬季样品分为13个OTU，且夏季样品和冬季样品序列无相近序列划分为1个OTU.用混乱度估计值的方法对文库的物种丰富度进行估算，冬季样品指数为31.33高于夏季样品指数10.50;通过计算香农指数及辛普森优势度指数倒数来分析细菌的多样性，冬季样品都高于夏季样品，因此，可以得出冬季样品的物种丰富度和生物多样性都高于夏季样品.
表2 湿地系统中氨氧化古菌的生物多样性
对人工湿地夏季和冬季样品OTU代表序列和GenBank数据库中的相近序列建立系统发育树如图 4 所示.其中，人工湿地中古菌AOA amoA基因序列的分类操作单元夏季样品以OTU-S开头表示，冬季样品以OTU-W开头表示.由图可知人工湿地土壤中古菌amoA基因序列在系统发育树中分成了两大支系，土壤支系和海洋水体支系.而土壤支系中的Nitrososphaera gargensis、Nitrososphaera viennensis EN76及C and idatus Nitrosocaldus yellowstonii，海洋支系中的Nitrosotale adevanaterra、Cenarchaeum symbiosum A、Nitrosopumilus sp. NM25和Nitrosopumilus maritimus SCM1均已被划入一个新的古菌类群—奇古菌门(Thaumarchaeota)，所以湿地系统土壤中的氨氧化古菌均属于奇古菌门.
图 4 依据amoA功能基因序列构建的氨氧化古菌系统发育树
湿地系统在低温条件下间歇运行后，土壤多样性发生了变化，可看出明显的季节性差异.其中夏季样品全部属于土壤支系，75%的序列(5个OTU)与中度嗜温菌C and idatu Nitrososphaera gargensis相似度较高.而冬季样品各个OTU差异度较高，其中11个OTU属于土壤支系，土壤支系中OTU-W8#和OTU-W12#与中度嗜温菌C and idatu Nitrososphaera gargensis相似度达89%和92%，OTU-W7#与Nitrososphaera viennensis EN76相似度达89%，同时还产生很多新的支系，可能属于一些还未被定义的新古菌;还2个OTU属于海洋水体支系，其中OTU-W11#与来自根际土壤的Nitrosoarchaeum koreensis MY1相似度高达95%，OTU-W11#和OTU-W13#和来自海洋的Nitrosopumilus maritimus相似度达90%和81%.
本文中的参比序列来自GenBank数据库，括号中字母和数字为序列提交序号.分支节点上的数字为每1000次Bootstrap分析所支持的概率，发育树左下方标尺表示5%序列差异的分支长度.
4 讨论
硝化过程是氮循环中生化机制中重要的一步，而氨氧化过程是硝化过程的第一步，古菌AOA和细菌AOB对氨氧化过程的相对贡献率，是目前氮循环研究中的热门问题.由于AOB在低温条件下生长受到抑制，探索AOA在低温条件下对氨氧化过程的贡献率具有重要的意义.在不同的湿地环境中，AOA和AOB的优势地位各不相同.本文构建间歇流人工湿地在低温条件下运行，由于湿地系统运行的影响因素很多，作用机理较复杂，所以主要从水力负荷和停留时间两个变量进行控制，研究在不同运行条件下，湿地系统中古菌AOA和细菌AOB的变化.
在平均气温为5 ℃时，不同水力负荷下湿地系统对氨氮去除效率都很高，达98%以上，且湿地系统中氨氧化古菌和氨氧化细菌的amoA基因丰度都较高，这说明在5 ℃时并没有抑制土壤中古菌AOA和细菌AOB的生长，但在不同的水力负荷下个湿地中AOA、AOB中amoA基因的丰度发生变化，并且在水力负荷为4.8 cm · d-1时还同时促进了古菌AOA和细菌AOB的生长，这说明合理的水力负荷有利于湿地系统中氨氧化微生物的富集.假设每个AOA细胞有1个拷贝的古菌amoA基因，每个AOB细胞有2.5个拷贝的细菌amoA基因，则可进一步计算由AOA和AOB共同作用下的比细胞硝化速率，范围在0.04~0.06 fmol · cell-1 · d-1(以NH3计，下同)，这与以往研究的最低值0.2 fmol · cell-1 · d-1相比较低，这可能是由于进水氨氮浓度较低，湿地系统中氨氮负荷低，导致硝化速率潜势较低.在本文中，由于湿地中投加活性污泥，检测出的古菌AOA丰度较高，高于自然界中检测到的丰度值，且在低温条件下可能有部分AOA和AOB没有参与进氨氧化过程中去.
在平均气温为-5 ℃时，停留时间为21 h时，氨氮的去除率最高为81%.湿地系统中AOA和AOB amoA基因的丰度明显下降，低温抑制了AOA和AOB的生长，但AOA丰度仍高于AOB 2.9~32.8倍，且土壤的硝化速率潜势并没有降低，可能由于低温抑制了AOA部分种群的生长，而剩余部分在这个运行条件下比较完全的参与了氨氧化的过程，所以氨氮去除率较高.在停留时间最短时，AOA中amoA基因的丰度减少最少，可能较短的水力停留时间有利于AOA的生长，但不利于土壤对氨氮的吸附沉淀作用，所以氨氮去除率很低.由图 3可知，AOA/AOB丰度的比值和土壤硝化速率呈正相关，在比值小于10时，氨氮去除率较高，当比值大于30时，氨氮去除效率最低，是否在AOA主导的环境中，AOA和AOB丰度的合理比值能增强土壤系统中的氨氮去除率，还需进一步实验证明.且在-5 ℃时，湿地系统中的古菌和细菌的比细胞硝化速率活性增加到0.19~1.5 fmol · cell-1 · d-1，并在氨氮去除率最高时，比细胞速率最高为1.5 fmol · cell-1 · d-1.与Sims等(2012)对自然湿地的比细胞速率值相比较低，与Santoro等(2010)对加利福尼亚海流中部的比细胞硝化速率的研究的结果：0.2~15.0 fmol · cell-1 · d-1相比较一致.
在不同水力负荷和不同停留时间运行时，AOA丰度都高于AOB，这与报道的认为在低温、低氨氮浓度(2.5~13.5 mg · L-1)时AOA丰度较高，比AOB生长的更好的结果相一致，且和硝化速率呈正向变化趋势，说明在低温、低氨氮这种极端环境下，AOA比AOB在氨氧化过程中更具有竞争优势.
本文对夏季和冬季-5 ℃样品中的氨氧化古菌生物多样性进行比较.在低温低氨氮环境下运行后的AOA多样性产生了明显的季节性差异，夏季样品AOA分别含有8个OTU，冬季样品含有13个OTU，具有较高的生物多样性.符合已报道的在人工湿地和人工施肥的土壤中AOA的物种多样性相对丰富，在天然湿地和野生土壤中AOA的多样性明显减少的说法.夏季样品的AOA序列全部属于土壤支系，且大多数与嗜温菌相似度较高，这与湿地系统的运行温度有很大关系;而冬季样品中各OTU差异度较大，与夏季样品相比多样性增多，既有土壤支系的，还出现了近似于海洋水体分支的新种群，这可能与间歇式运行方式有关，在湿地系统中形成了人工消落带，且低温低氨氮的环境改变了湿地系统中AOA种群的结构，增加了土壤中AOA的多样性.因此，推测在低温条件下，湿地系统中AOA在氨氧化过程中起主导作用.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
5 结论
1)冬季平均气温为5 ℃时，人工湿地宜采用表层布水管进水，水力停留时间21 h，水力负荷4.2 cm · d-1，氨氮去除率达99%;平均气温降为-5 ℃，宜采用中间布水管进水，水力停留时间为21 h，水力负荷3.6 cm · d-1，氨氮去除率达81%，去除效率稳定.
2)在低温、低氨氮环境中，不同运行条件下的湿地系统中AOA丰度均高于AOB丰度(2.9~33.2倍)，且AOA丰度与土壤硝化速率呈正向变化趋势，说明在这种环境下湿地系统氨氧化过程中AOA比AOB更具有优势.
3)湿地系统中氨氧化古菌的生物多样性具有季节性差异，在低温低氨氮环境下，AOA的种群结构发生了变化，由夏季的8个OTU增加到了13个OTU，其中夏季样品全部属于土壤支系，冬季样品11个OTU序列属于土壤支系，2个OTU序列属于海洋水体支系.夏季和冬季样品中的氨氧化古菌均属于一个新命名的古菌类群——奇古菌门.