1 引言
养殖污水和液态排泄物是集约化畜禽养殖场污染物无害化处理的难点.目前，规模化畜禽养殖场的污水通常采用沼气池厌氧发酵进行处理，但产生的数量巨大的沼液中仍然含有高浓度的氮磷等营养盐.随着农村城镇化进程的推进，消纳沼液的耕地日渐不足，产生的沼液直排到水体中，将会导致自然水体严重富营养化.如何净化沼液越来越成为规模化畜禽养殖场可持续发展的制约因素.
微藻属于光合自养型生物，在自然界广泛分布，能有效吸收利用水体中的氮磷等营养物质，很早就被人们用以处理污水、净化环境.同时，微藻也是十分重要的生物资源，微藻细胞营养丰富，含多种生理活性物质，某些微藻在特定的培养条件下能选择性地蓄积高附加值的产品.利用微藻生产生物柴油或单细胞饲料蛋白源是当前微藻开发利用的热点.若能利用养殖场污水培养产油微藻，既可以利用微藻净化污水，还能为微藻生物柴油的生产提供资源，一举两得.
因此，本文选择了15株淡水微藻，在实验室条件下考察其在猪场养殖污水中的生长性能及其对污水中氮磷的去除效果，并检测利用猪场养殖污水培养的各株微藻的细胞蛋白含量和脂肪酸组成，以期为猪场养殖污水的无害化高效净化处理筛选出合适的藻株.
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 猪场养殖污水
猪场养殖污水取自浙江嘉兴余新镇敦好农牧有限公司的养猪场.养殖污水经过厌氧发酵及露天氧化塘沉淀处理后，用于本试验.试验用污水的水质状况如表 1所示.
表1 试验用猪场养殖污水的水质状况
2.1.2 试验藻株
试验用15个藻株均取自上海海洋大学生物饵料研究室微藻种库，分别为纤维藻(Ankistrodesmus sp.)SHOU-F1、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)SHOU-F3、单生卵囊藻(Oocystis solitaria)SHOU-F5、多棘栅藻(Scenedesmus spinosus)SHOU-F7、多棘栅藻(S. spinosus)SHOU-F8、肥壮蹄形藻(Kirchneriella obesa)SHOU-F9、斜生栅藻(S. obliquus)SHOU-F17、淡水小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F19、椭圆小球藻(Ch.ellipsoidea)SHOU-F20、斜生栅藻(S.obliquus)SHOU-F21、四球藻(Tetrachlorella alternans)SHOU-F24、镰形纤维藻(A.falcatus)SHOU-F26、小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F28、四尾栅藻(S. quadric and a)SHOU-F35和针形纤维藻(A. acicularis)SHOU-F120.
2.2 试验方法
2.2.1 藻种接种及培养
将各藻株先于f/2培养基中扩培，待培养到一定数量后，离心收集藻细胞，将藻细胞分别接种到经高压灭菌后的猪场养殖污水中，接种密度为2.0×106 cells · mL-1左右.将接种后的藻液在温度25 ℃、光照1800 lx、光照周期24 h/0 h(L : D)的条件下培养，每天定时摇瓶.培养20 d后，测定藻细胞密度、培养液氮磷含量、藻细胞蛋白含量及脂肪酸组成.
2.2.2 微藻生长检测
培养开始和结束时用血球计数板测定藻细胞密度，并根据公式K=(lnNt -lnN0)/t计算相对生长率，其中，N0为培养初始藻细胞密度(cells · mL-1)，Nt为经过t时间后培养液中的藻细胞密度(cells · mL-1)，t为培养时间(d).测定平行3次.
2.2.3 藻细胞干重测定
取30 mL藻液，用预先恒重的0. 45 μm 滤膜抽滤，然后将滤膜再次恒重，计算藻细胞的生物量.测定平行2次.
2.2.4 水质指标测定
用0.45 μm 滤膜过滤藻液，然后参照水和废水监测分析方法(第4版)(国家环境保测定滤液中氮磷，总氮测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法，氨态氮测定采用纳氏试剂分光光度法，硝态氮测定采用紫外分光光度法，总磷测定采用钼酸铵分光光度法.测定设2个平行.
氮、磷去除率r的计算公式为：r=(C0-Ct)/C0×100%，其中，C0和Ct分别为初始氮磷的浓度和培养t天后的浓度(mg · L-1).
2.2.5 蛋白含量测定
藻细胞蛋白含量的测定参照福林-酚测蛋白法进行，每藻株平行测定3次.
2.2.6 脂肪酸含量测定
藻细胞脂肪酸含量的测定参照文献方法进行.称100 mg湿样(离心后去水)至带硅胶衬里螺旋帽的15 mL棕色螺纹口顶空瓶中，加入250 μL C19-甲苯溶液(浓度0.2 mg · mL-1)，漩涡混匀后，加2 mL甲醇钠(NaOMe，0.5 mol · L-1)，置于超声波清洗机中80 ℃水浴混匀20 min;冷却至室温后，加2 mL BF3-甲醇溶液(14%)，再置于超声波清洗机中80 ℃水浴混匀20 min;冷却至室温后，加800 μL去离子水和1200 μL正己烷，漩涡混匀后，4000 r · min-1离心3min，将上层含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯层转移至小玻璃瓶中，于气相-质谱联用仪上参照文献方法检测脂肪酸含量.定量分析时采用对各组分峰面积积分，用归一化法计算出脂肪酸组分的百分含量(以占脂肪酸总量的百分比表示).
各微藻脂肪酸甲酯的理论烷基值参照文献的方法进行计算(Cetane Number，CN).
2.3 数据的统计分析
结果以平均值±标准差表示，采用PASW.Statistics.18.0软件进行方差分析并作Duncan多重比较，p<0.05表示差异显著.
3 结果
3.1 不同微藻藻株在猪场养殖污水中的生长性能
由表 2可以看出，试验条件下，小球藻SHOU-F28相对生长率最高，为0.15;其次为多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8和斜生栅藻SHOU-F21，3种栅藻的相对生长率分别为0.12、0.13和0.11;单生卵囊藻SHOU-F5、椭圆小球藻SHOU-F3、斜生栅藻SHOU-F17和针形纤维藻SHOU-F120的相对生长率最低.
表2 不同微藻藻株在猪场养殖污水中的生长性能
3.2 不同微藻藻株对猪场养殖污水中总氮的去除效果
猪场养殖污水经高压灭菌消毒后，水体中氮含量略有减少，总氮为30.00 mg · L-1，氨态氮14.00 mg · L-1，硝态氮14.00 mg · L-1.不同藻株对养殖污水中总氮表现出不同的去除效果(表 3)，多棘栅藻SHOU-F7和多棘栅藻SHOU-F8的总氮去除率最高(均为93.25%)，其次为四尾栅藻SHOU-F35(92.74%)、单生卵囊藻SHOU-F5(91.73%)和斜生栅藻SHOU-F21(87.78%)，纤维藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19、小球藻SHOU-F28和针形纤维藻SHOU-F120对猪场养殖污水总氮的去除率较低，去除率仅为50.00%左右.
表3 不同微藻藻株对猪场养殖污水中总氮的去除效果
3.3 不同微藻藻株对猪场养殖污水中氨态氮的去除效果
从氨态氮的去除率来看(表 4)，椭圆小球藻SHOU-F3、单生卵囊藻SHOU-F5、多棘栅藻SHOU-F8、肥壮蹄形藻SHOU-F9、斜生栅藻SHOU-F17、椭圆小球藻SHOU-F20、斜生栅藻SHOU-F21、四球藻SHOU-F24、镰形纤维藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾栅藻SHOU-F35对氨态氮的去除率均在95.00%以上，去除率最低的是淡水小球藻SHOU-F19，去除率为78.43%.
表4 不同微藻藻株对猪场养殖污水中氨态氮的去除效果
3.4 不同微藻藻株对猪场养殖污水中硝态氮的去除效果
由表 5可知，多棘栅藻SHOU-F7和多棘栅藻SHOU-F8对污水中硝态氮的去除率最高，均达100%;其次为四尾栅藻SHOU-F35(99.61%)、单生卵囊藻SHOU-F5(99.21%)和斜生栅藻SHOU-F21(97.14%);针形纤维藻SHOU-F120对硝态氮的去除率最低，仅为39.75%.
表5 不同微藻藻株对猪场养殖污水中硝态氮的去除效果
3.5 不同微藻藻株对猪场养殖污水中总磷的去除效果
由表 6可知，试验用各株微藻对猪场养殖污水中总磷的去除率很高，基本在90.00%以上，尤以斜生栅藻SHOU-F21、淡水小球藻SHOU-F19、多棘栅藻SHOU-F7、四尾栅藻SHOU-F35和多棘栅藻SHOU-F8对总磷的去除率高，可达到97.00%以上.
表6 不同微藻藻株对猪场养殖污水中总磷的去除效果
3.6 利用猪场养殖污水培养的微藻细胞蛋白含量
利用猪场养殖污水培养的各株试验微藻的藻细胞蛋白含量介于23.87%~43.90%之间(表 7).椭圆小球藻SHOU-F3、针形纤维藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分别为43.90%、38.28%和37.35%，显著高于其他微藻.多棘栅藻SHOU-F7和多棘栅藻SHOU-F8的细胞蛋白含量最低.
表7 猪场养殖污水培养的微藻藻细胞蛋白含量
3.7 利用猪场养殖污水培养的微藻藻细胞脂肪酸组成
由表 8可以看出，15株微藻细胞脂肪酸组成各不相同，但16 : 0和18 : 3n3含量在所有藻株中均较高.3种纤维藻(纤维藻SHOU-F1、镰形纤维藻SHOU-F26和针形纤维藻SHOU-F120)的脂肪酸组成相近，16 : 0、16 : 4n3、18 : 1n9、18 : 2n6和18 : 3n3是纤维藻的主要脂肪酸.4种小球藻中，椭圆小球藻SHOU-F3和椭圆小球藻SHOU-F20的脂肪酸组成较接近，含有极丰富的18 : 2n6，且18 : 3n3和16 : 2n6含量较高;淡水小球藻SHOU-F19含丰富的18 : 3n3和18 : 1n9，18 : 2n6的含量很低;小球藻SHOU-F28含丰富的18 : 3n3和18 : 2n6，但18 : 1n9和16 : 2n6的含量很低.5种栅藻中，多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、斜生栅藻SHOU-F21和四尾栅藻SHOU-F35均含有较为丰富的18 : 2n6和18 : 3n3，而斜生栅藻SHOU-F17含有极丰富的18 : 3n3，但18 : 2n6含量较低.单生卵囊藻SHOU-F5和肥壮蹄形藻SHOU-F9的脂肪酸组成中，18 : 3n3含量很高，但18 : 2n6含量较低.根据脂肪酸组成计算得到的脂肪酸甲酯的理论烷基值，多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和针形纤维藻SHOU-F120的理论烷基值较高，分别为48.70、47.21、47.66和47.06.
表8 猪场养殖污水培养的微藻藻细胞脂肪酸组成
4 讨论
微藻是光能自养型生物，以水为电子供体，以CO2为碳源，通过光合作用将光能转化为化学能贮存在藻细胞内供细胞代谢.在代谢过程中，微藻细胞需要将环境中的N、P等元素吸收到藻细胞内，以合成藻细胞内各组成成分，在此过程中细胞外环境中的氮磷水平逐步降低.此外，微藻细胞对水环境中的N、P及重金属等物质也具有不同程度的吸附及富集作用，从而使污水得到净化.从15株微藻在猪场养殖污水中的生长性能可以看出，多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8和斜生栅藻SHOU-F21的相对生长率高，细胞增长快，说明上述栅藻具有较高的耐污能力，这与很多学者报道的关于选用栅藻来处理生活污水或者工业污水是一致的.
从各株微藻对养殖污水中总氮的去除率看，多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、四尾栅藻 SHOU-F35、斜生栅藻SHOU-F21和单生卵囊藻SHOU-F5对猪场养殖污水的总氮去除率都很高，经多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8和四尾栅藻SHOU-F35处理后，养殖污水的总氮水平接近2 mg · L-1，基本达到了地表水环境质量标准(GB 3838-2002)的Ⅴ类水总氮要求.从各株微藻对养殖污水中氨态氮的去除率看，除纤维藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19及针形纤维藻SHOU-F120外，其余试验微藻均能将养殖污水中的氨态氮从14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下，达到地表水环境质量标准(GB 3838-2002)的Ⅴ类水氨态氮要求，其中，椭圆小球藻SHOU-F3、单生卵囊藻SHOU-F5、多棘栅藻SHOU-F8、肥壮蹄形藻SHOU-F9、斜生栅藻SHOU-F17、椭圆小球藻SHOU-F20、四球藻SHOU-F24、镰形纤维藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾栅藻SHOU-F35更是将污水的氨态氮降到0.5 mg · L-1以下，达到了地表水环境质量标准Ⅱ类水标准.报道小球藻对模拟的养殖废水的氮磷有很好的去除效果，对水体中氨态氮的去除率达到80%以上，对磷的去除率达到85%以上.利用蛋白核小球藻和栅藻对沉淀的污水和活性污水进行处理，结果表明，两种微藻对沉淀的污水的总磷和无机氮的去除率达到80%，并且蛋白核小球藻比栅藻处理效果更好.利用蛋白核小球藻对乙醇发酵的废水进行处理可以实现废水的循环利用.从各株微藻对养殖污水中硝态氮的去除效果看，单生卵囊藻SHOU-F5、多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、斜生栅藻SHOU-F17、斜生栅藻SHOU-F21和四尾栅藻SHOU-F35也均能将养殖污水中的硝态氮从14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下.15株微藻对猪场养殖污水中总磷的去除率都很高，均在90%以上，经微藻处理后的养殖污水中总磷的水平均降低到0.2 mg · L-1以下，达到了地表水的Ⅱ~Ⅲ类标准.因此，综合本试验各株微藻对养殖污水中总氮、氨态氮、硝态氮和总磷的净化效果，多棘栅藻SHOU-F8和四尾栅藻SHOU-F35能够将猪场养殖污水净化并达到排放标准.
不同藻种及同种藻不同株系对污水中不同形态氮的净化效果可能与藻种(株)的内在生理特性差异有关.已有报道表明，小球藻对污水中氨态氮的去除效果较好.研究认为，小球藻能够较好地去除水产加工废水中的氨态氮.报道，小球藻在无光异养条件下能利用啤酒厂污水中多种营养成分，且能去除污水中的氨态氮并将它们转化为细胞中的蛋白质、叶绿素等含氮物质，同时显著地降低污水中的COD和BOD.的研究表明，斜生栅藻去除硝态氮效果最好.利用栅藻LX1对由不同氮源配制的培养液进行处理，结果表明，栅藻LX1对以硝酸盐和尿素作为氮源的培养液的氮磷去除效果较氯化铵作为氮源的好，能去除90%的总氮和将近100%的总磷;而氯化铵作为氮源，氮磷的去除率仅为31.1%和76.4%.微藻对水环境中氮磷的净化效果也与藻细胞浓度、pH、温度、光照强度和培养周期等影响藻类生长的因素有关.培养液中氮磷组合浓度不同会影响小球藻对氮磷的吸收，升高温度或加强光照有利于小球藻对磷、氮的吸收，在最佳pH条件下，小球藻对氮磷的吸收率可达80%左右.
由于鱼粉资源的短缺，新型饲料蛋白源的开发是水产动物营养与饲料研究的热点之一.单细胞微藻蛋白是重要的潜在蛋白源，螺旋藻和小球藻已作为单细胞蛋白源和饲料添加剂加以应用.本研究表明，15株微藻细胞蛋白含量均在20%以上，达到蛋白质饲料的标准.其中，椭圆小球藻SHOU-F3、针形纤维藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分别达43.90%、38.28%和37.35%，可与常用植物蛋白源豆粕(蛋白含量42%~48%)及菜籽粕(35%~38%)相媲美.而且，椭圆小球藻SHOU-F3、针形纤维藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的细胞中含有丰富的亚油酸(18 : 2n6)和亚麻酸(18 : 3n3)(表 8).亚油酸和亚麻酸是陆生动物及淡水鱼类的必需脂肪酸.因此，利用猪场养殖污水开展椭圆小球藻SHOU-F3、针形纤维藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的培养以获得饲料蛋白源或饲料添加剂具有潜在的开发价值.
本研究中，单生卵囊藻SHOU-F5、肥壮蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分别为35.03%、31.24%和30.73%.而在适宜的光照和温度条件下用f/2培养基培养的单生卵囊藻SHOU-F5、肥壮蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分别为27.61%、25.09%和23.08%.本研究各微藻的蛋白含量均较高，这可能与微藻培养液中氮的水平差异有关.已有的研究表明，培养液中高的氮磷浓度有利于微藻合成蛋白质.养殖污水中的氮磷含量显著高于f/2培养基中的氮磷水平.
21世纪，人类面对能源和水资源双重危机和挑战，基于微藻培养的污水深度处理和生物柴油生产耦合系统具有广阔的发展前景.微藻生产生物能源中，利用污水培养产油微藻，既可以利用微藻使污水再生利用，还可以为能源微藻生产生物柴油提供资源，一举两得.概述了微藻深度脱氮除磷技术、微藻生产生物能源的研究现状，并提出了将污水处理工艺和生产工艺耦合的概念，实现污水处理系统从“处理工艺”向“生产工艺”的转化利用二级污水对分离出的淡水栅藻进行摇瓶培养，并和11种高油脂含量的微藻进行比较，结果显示，栅藻对污水有很强的耐受力，生物量能达到0.11 g · L-1，总脂含量为31%~33%，在10 d培养中，油脂产率最高为0.008 g · L-1 · d-1，并且能有效地去除无机营养物质，总氮总磷去除率达到98%，说明栅藻是耦合污水处理和生产生物柴油的优良藻种.
烷基值是影响生物柴油点火性能的关键因素，也影响生物柴油燃烧后的污染物排放水平，高烷基值的生物柴油往往具有较低的氮氧化物排.而微藻生物柴油的烷基值则由微藻脂肪酸组成决定.根据美国生物柴油标准，生物柴油烷基值最低不得低于47，而从本研究中各株微藻脂肪酸甲酯的理论烷基值看，多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和针形纤维藻SHOU-F120的理论烷基值(CN)较高，分别为48.70、47.21、47.66和47.06.因此，利用猪场养殖污水养殖多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和针形纤维藻SHOU-F120用于微藻生物柴油的生产具有较好的可行性.从污水净化耦合微藻生物柴油生产角度考虑，多棘栅藻SHOU-F8是合适的藻株.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
5 结论
1)多棘栅藻SHOU-F7、多棘栅藻SHOU-F8和四尾栅藻SHOU-F35是猪场养殖污水氮磷净化的适宜藻株，能够将养殖污水的氮磷降低到地表Ⅴ类水标准，且多棘栅藻SHOU-F8是猪场养殖污水净化耦合微藻生物柴油生产的合适藻株.
2)利用猪场养殖污水培养的椭圆小球藻SHOU-F3、针形纤维藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28，具有高的蛋白含量(37.35%~43.90%)及丰富的亚油酸和亚麻酸，具备作为饲料蛋白源或饲料添加剂的潜在开发价值.