1 引言
人工湿地(Constructed Wetlend)是20世纪70年代发展起来的一种污水处理技术，它是通过基质-土壤-微生物的综合作用实现对污染物去除，其中微生物是对污染物进行吸附和降解的主要生物群体和承担者，微生物在湿地基质中与其他动物和植物共生体的相互关系往往起着核心作用.由于其具有良好的污染物去除效果，可观的经济效益和广泛的适用性，已经引起世界各国研究者的重视.
人工湿地中微生物的作用是净化污水的最主要因素.微生物广泛存在于自然生态系统中，根据其生长温度特性可分为：低温微生物、中温微生物和高温微生物3类.低温微生物是指在极端低温环境下能够生长的微生物，它们具有独特的生理机制和特殊的代谢产物，主要分为嗜冷菌(Psychrophilies)和耐冷菌(Psychrotrophs)两类.前者是必须生活在低温条件下，即在0 ℃下生长繁殖，最适温度不超过15 ℃，最高温度不超过20 ℃的微生物，后者是能在低温条件下生长，在0～5 ℃下可生长繁殖，最高生长温度可达20 ℃的微生物.在寒冷的冬季这些低温微生物在人工湿地生态系统中起着非常重要的作用，为人工湿地污水处理提供了崭新的应用前景.
国外对低温微生物处理污水技术的研究起步较早，我国从20世纪90年代初开始针对低温微生物资源(主要是南极及深海微生物)的初步收集、调查与研究工作.目前对低温微生物的研究与开发较少，力量还比较薄弱，其研究也没有达到一定的深度，有关人工湿地低温菌的研究更少.本实验研究了低温菌Pseudomonas flava WD-3在冬季接种到人工湿地后对污水的处理效果，并构建污水处理动力学模型，其成果必将为解决寒冷地区冬季人工湿地的污水处理提供理论基础和技术支持，对于解决我国日益严重的水污染和缺水的问题有着十分重要的意义.
2 材料与方法
2.1 Pseudomonas flava WD-3 的富集培养、分离、筛选和鉴定
2.1.1 菌株的富集培养与分离
将从人工湿地中采集的泥样(温度10 ℃)放入4 ℃培养箱中培养驯化，然后取1 g泥样接入三角瓶中振荡培养，使微生物快速生长，达到富集的作用.选取原浓度10-4～10-6倍的培养液各1 mL，接种于培养基平板上(设置3个平行)，放入8 ℃培养箱中培养并记录各平板菌株生长状况.从中筛选出长势较好的菌株，然后反复分离纯化获得单菌落，将单菌落接种到试管斜面培养基上，于4 ℃冰箱内保存.
2.1.2 菌株的筛选
将分离出的单菌落富集培养，接种于模拟污水中，曝气后静置培养，定期测量废水中COD、总磷和氨氮的含量，计算出各菌株对其去除率，筛选出去除效率最好的菌株E进行进一步的研究实验.
2.1.3 菌株的鉴定
将筛选出的菌株E进行形态观察，生理生化试验及16S rDNA序列分析.
2.1.4 菌株E对废水的去除
按照探究出的最适生长条件，对菌株E再次进行模拟废水去除实验，测量计算出其对COD、总磷和氨氮的去除效率，与实验初期的去除效率比较，得出更加全面的实验结论.
2.2 复合垂直流构建湿地结构
实验构建湿地采用复合垂直流结构设计，底部相通，污水由下行池表面均匀投配，垂直下行，经连通层到达上行池，再垂直上行，通过收集管排出.其中下行流池长150 cm，宽100 cm，深65 cm，上行流池长120 cm，宽100 cm，深55 cm，卵石层深20 cm，水力停留时间：10 d;投配负荷：2～20 cm · d-1;有机负荷：15～20 kg · hm-2 · d-1.湿地基质选用了不同粒径的砾石和砂土特别组配而成，湿地结构如图 1所示，其中图中箭头表示污水流动方向.
图 1 复合垂直流构建湿地系统结构示意图
系统所选植物为除污能力强的常见湿地植物美人蕉(Canna generalis)和菖蒲(Acorus calamus)，在2012年4月份种植于人工湿地反应器中，种植密度为8株 · m-2，湿地植物生长状况良好，已完全遮盖基质表面，根系发达，至实验时为止，该系统已稳定运行半年时间.系统进水参数见表 1.
表1 人工湿地系统进水参数
2.3 低温菌Pseudomonas flava WD-3在人工湿地中的废水处理效果
人工湿地系统稳定运行半年后，于2013年1月中旬(水温的变化范围为6～8 ℃.)开始投入低温菌Pseudomonas flava WD-3，接种量V(菌液)/V(污水)为1.5%～10%，菌悬液的浓度为4.575×108 个 · mL-1，以未接菌的人工湿地为对照组.追踪测定氨氮、COD、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总磷的变化情况，并构建低温菌废水处理的动力学模型.
2.4 水质指标的测定
氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法，亚硝酸盐氮的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝酸盐氮的测定采用酚二磺酸分光光度法，总磷的测定采用钼酸铵分光光度法，CODCr的测定采用重铬酸钾氧化法，各指标测定的具体操作步骤详见《水和废水监测分析方法》(第4版).
3 结果与讨论
3.1 Pseudomonas flava WD-3 的鉴定结果与模拟废水处理效果
在8 ℃下培养菌株E表现为湿润、边缘整齐、半透明的圆形乳白色菌落，革兰氏染色试验菌株E呈阴性，显微镜下观察为杆状，葡萄糖氧化发酵试验产酸不产气;蔗糖氧化发酵试验产酸不产气;柠檬酸盐试验阳性;明胶水解试验阳性;氧化酶试验阳性;淀粉水解试验阴性;甲基红(MR)试验阳性;过氧化氢酶试验阳性;产H2S试验阳性;吲哚试验阳性.经鉴定菌株E的16S rDNA特异序列为1424 bp，对该序列进行BLAST检索，应用Clustal W和PHYLIP软件分析并构建了进化树，见图 2.从分析结果可知，菌株E与假单胞菌同源性高达100%.因此结合该菌株的形态特征及生理生化反应特性，可初步鉴定菌株E为黄假单胞菌(Pseudomonas flava)，命名为Pseudomonas flava WD-3.
图 2 菌株E的系统进化树
该菌株对模拟废水中COD、总磷、氨氮的降解率分别为62.92%、56.42%、50.63%，且对废水的降解性能稳定.
3.2 不同接种量情况下污水处理效果
在水力停留时间10 d内，水温为6～8 ℃时，不同接种量对复合垂直流湿地中污水的氨氮、CODCr、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总磷去除效果如图 3.
从图 3可以看出，在1.5%～10.0%的接种量情况下，随着低温菌投加量的增加，湿地系统污水中的NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除效率也随之增大.当投加量由1.5%增至6.0%时，湿地系统各项污水指标的去除效果增幅明显，但是从6.0%至10.0%时，各项污水指标的处理效果增幅并不明显.当菌液投加量为10.0%时，虽然各项污水指标去除效果最好，但投入过大，从运行成本方面考虑宜选用6.0%为最佳菌液投加量.
图 3 湿地系统中NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP浓度随时间的变化(见图a、b、c、d、e)
从图 4可以看出，当实验菌液投加量为6.0%，水力停留时间10 d内，水温为6～8 ℃的条件下，随着时间的延长，Pseudomonas flava WD-3对水质各项指标的去除率逐渐增加，最终对NH+4-N的去除率可达83.57%，对COD的去除率可达86.31%，对NO-2-N的去除率可达95.07%，对NO-3-N的去除率可达94.74%，对TP的去除率可达84.76%，且各去除效率分别为未投加该菌的1.49、1.48、1.45、1.41、1.83倍.同时，该试验结果表明，在人工湿地中Pseudomonas flava WD-3对污水NH+4-N、COD、TP的去除效果有明显的提高，分别是实验室模拟废水处理效果的1.65、1.37、1.50倍，且去除性能稳定.其原因可能是：人工湿地是由基质、微生物、植物和动物所组成的复合生态系统，对污水起着物理、化学和生物综合净化功能.首先，人工湿地中的基质(土壤、沙砾等)对污水中的污染物质存在沉淀、吸附和简单的机械截留等作用;第二，人工湿地系统中的植物对污水中污染物具有吸收和代谢的作用;第三，人为投加的Pseudomonas flava WD-3和人工湿地中土著微生物通过同化和异化作用对污水中的有机物质、氮和磷达到去除的目的.
图 4 NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除率随时间的变化
3.3 污水处理动力学方程
动力学研究可以优化生化处理的工艺条件及调控方式，并通过建立降解动力学模型，模拟最适当的工艺流程和工艺参数，预测微生物降解废水的趋势.湿地设计通常采用的是一级动力学模型，其基本设计方程被澳大利亚、欧洲、美国广泛应用于湿地的设计和对湿地的污染物去除效果的预测.虽然有局限性，但由于其参数的求解及计算过程都很简单，因此，目前仍把它作为描述湿地中污染物去除过程的最合适的方程.
用于湿地的一级动力学方程，主要考虑处理负荷与处理效率之间的关系，模型的推导以基质的降解服从一级反应动力学为基础.污染物在人工湿地中的降解去除一级动力学模式为：
式(1)～(2)中，kv为污染物体积去除速率常数(d-1);Ci为进水浓度(mg · L-1);C0为出水浓度(mg · L-1);t : 水力停留时间(d).
根据以上动力模型，将不同投菌量时湿地系统出水中各污染物浓度记作C0(水力停留时间10 d内)，湿地系统进水浓度计作Ci，用 C0/Ci为纵坐标(无量纲污染物浓度)，以时间为横坐标，绘制NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N和TP的时间变化曲线，如图 5所示.同时，将各投菌量在水力停留时间第10 d时的NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N和TP的测定结果代入式(2)，计算出 kv如表 2所示.
通过对不同投菌量时人工湿地中各污染物的变化规律进行分析后可以看出，Pseudomonas flava WD-3在人工湿地中对污水中各污染物去除动力学符合一级动力学模型.
图 5 1.5%(a)、3.0%(b)、6.0%(c)和10.0%(d)投菌量时污染物浓度随时间的变化特点
表2 人工湿地中污染物的去除一级动力学速率常数kv
体积去除速率常数kv的大小代表着污染物降解速率的大小，在水力停留时间10 d内，Pseudomonas flava WD-3对各污染物有着较大的降解速率，且随着投菌量的增加，其对各污染物的降解速率也随着增加，各kv的R2分别达0.96、0.81、0.74、0.88和0.88.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
4 结论
1)Pseudomonas flava WD-3对冬季人工湿地的污水具有良好的净化效果，综合运行成本方面考虑宜选用6.0%为最佳菌液投加量.
2)在最佳投加量的情况下，Pseudomonas flava WD-3对污水中NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除效率分别是未投加低温的1.49、1.48、1.45、1.41、1.83倍，且去除性能稳定.
3)Pseudomonas flava WD-3对污水各污染物的降解过程符合一级反应动力学模型.