1 引言
生物除磷为去除城镇污水中磷的重要方法，也是保护地表水环境、减轻或避免水体富营养化的重要技术措施近年来，有研究认为生物除磷不仅与聚磷菌(PAOs)有关，而且可能与生物絮体中的胞外聚合物(EPS)有密切联系.例如，Cloete等和方振东等检测到EPS中含有大量磷，认为EPS是污泥絮体重要的磷贮存库;研究认为，EPS磷含量的变化为厌氧减小、好氧增大，且SRT越大，EPS磷含量越大，EPS除磷量越大;韩玮等则研究认为，厌氧/好氧反应过程中EPS含磷量呈波浪形变化，EPS在生物除磷过程中主要起缓冲作用，是胞内聚磷合成的中转站;研究发现，不同SRT下EPS含量没有明显变化，但EPS的磷含量随SRT的增大而增大.上述结果说明，EPS对生物除磷过程有重要影响，但其在生物除磷中的确切作用还不清楚.
有研究人员采用STS法(化学分级)和31P-NMR检测到细胞膜外或EPS中存在聚磷酸盐(Poly-P)，说明EPS参与了生物聚磷过程.Hill等(检测到以葡萄糖为部分碳源的SBR反应器活性污泥好氧吸磷形成的部分Poly-P位于细胞膜外.Jing等对该反应器进行了后续研究，发现细胞膜外的Poly-P与金属阳离子结合/络合.随着对生物絮体结构认识的深入，研究人员意识到上述现象与EPS有密切联系.张志超等观察到普通活性污泥EPS磷的主要形态为正磷酸盐(PO3-4-P)，而生物强化除磷污泥EPS磷的主要形态为Poly-P.然而，上述研究仅对细胞膜外或EPS中磷酸盐的形态进行了分析检测，未深入研究生物除磷过程中EPS不同形态磷酸盐(包括正磷酸盐、低分子量聚磷酸盐和高分子量聚磷酸盐)含量的动态变化.
为此，本文以两组不同SRT的实验室A/O-SBR反应器活性污泥为研究对象，采用STS法研究不同SRT和溶解氧(DO)下EPS磷酸盐含量的动态变化，深入剖析EPS磷酸盐形态对生物除磷过程的影响，以期为进一步明确EPS在生物除磷中的作用提供一定的科学依据.
2 材料与方法
2.1 活性污泥的来源
以两组实验室A/O-SBR反应器的活性污泥为研究对象，将SRT分别控制在10 d和30 d;其中，SRT为10 d的反应器记为1#，SRT为30 d的反应器记为2#.反应器采用瞬时进水，运行周期为12 h，其中，厌氧运行4 h，好氧运行7 h，沉降50 min，排水和闲置10 min.反应器进水采用人工配水，其COD ∶ N ∶ P为50 ∶ 5 ∶ 1;采用葡萄糖、淀粉、乙酸钠、丙酸钠和蛋白胨为复合碳源，KH2PO4为磷源，蛋白胨和NH4Cl为氮源，并投加适量微量元素.两组不同SRT的A/O-SBR反应器好氧反应结束前的DO浓度先后控制为0.7~1.0 mg · L-1和2.5~3.5 mg · L-1，分别代表DO受限(简称低DO)和DO适中(简称中DO)条件;低DO条件厌氧阶段初始时刻混合液的ORP为-200~-220 mV，中DO条件厌氧阶段初始时刻混合液的ORP为-40~-70 mV，通过DO条件短暂改变(约为3 d)考察DO对污泥絮体磷形态和分布、EPS磷酸盐形态及其动态变化的影响.
2.2 分析测量方法
取一定体积的活性污泥样品于4500 r · min-1下离心15 min，离心上清液经0.25 μm滤膜过滤，测量过滤液总磷(TP)和正磷酸盐(PO3-4-P)含量.向离心沉淀物补充4 ℃超纯水使污泥重新悬浮，其体积为40 mL，污泥浓度约为8000 mg · L-1(以VSS计).然后，采用超声波-树脂法提取EPS，提取EPS后的污泥颗粒视为细菌细胞.TP含量测定时采用封闭回流消解法预处理，其中，污泥中TP含量测定时需先将离心清洗后的污泥悬浮液进行超声波分散，用钼锑抗法测定TP和PO3-4-P含量.将部分污泥悬浮液和细菌细胞悬浮液于-50 ℃下真空冷冻干燥48 h，称取15~20 mg冻干样品，测量污泥和细菌细胞中不同形态磷的含量，并利用差减法计算EPS中不同形态磷的含量.DNA采用二苯胺法测定.
污泥和细菌细胞中不同形态磷含量的测定采用改进的STS法，具体测量步骤见图 1.该法将样品中的磷分为正磷酸盐(PO3-4-P)、低分子量聚磷酸盐(LMW Poly-P)、磷脂(Lipid-P)、DNA磷(DNA-P)、高分子量聚磷酸盐(HMW Poly-P)、蛋白质磷和残渣磷(Protein+Residue-P).混合离心提取液中TP含量测定时采用封闭回流消解法预处理，用钼锑抗法测定TP和PO3-4-P含量，DNA-P含量由DNA含量乘以系数9.2%计算得到(磷是DNA的特征元素，含量相对恒定)，差减计算得到LMW Poly-P和HMW Poly-P含量.
图 1 改进的STS法基本步骤
3 试验结果
3.1 SRT和DO对主体液相磷浓度变化的影响
由图 2可以看出，不同SRT和DO条件下反应器主体液相磷浓度的变化均表现为厌氧升高、好氧降低，说明两组A/O-SBR系统具有良好的生物强化除磷(EBPR)性能，聚磷菌(PAOs)获得生长竞争优势.反应器进水磷源为KH2PO4，反应过程中液相的PO3-4-P浓度占TP浓度的95%以上，说明污泥絮体厌氧释放和好氧吸收的磷主要为PO3-4-P.
图 2 运行周期中反应器主体液相磷浓度的变化
SRT为10 d时，中DO条件下1#反应器液相TP浓度的厌氧升高量和好氧降低量明显大于低DO条件，且液相TP浓度在厌氧初期(0~1 h)和好氧初期(4~5 h)有更大的变化速率;同时，中DO条件和低DO条件下液相TP浓度在好氧反应结束前分别为0.81 mg · L-1和5.65 mg · L-1，进水TP去除率分别为95.95%和71.75%.然而，SRT为30 d时，DO对2#反应器液相TP浓度的厌氧升高量和好氧降低量影响较小;同时，中DO条件和低DO条件下液相TP浓度在好氧反应结束前分别为3.63 mg · L-1和3.86 mg · L-1，进水TP去除率分别为81.85%和80.70%.上述结果说明，DO浓度的变化对中SRT(10 d)污泥系统的生物除磷过程及效果影响较大，而对高SRT(30 d)污泥系统的生物除磷过程及效果影响较小.这是因为高SRT污泥较中SRT污泥絮体的结构更为密实，前者絮体的微观生化环境受DO浓度变化的影响小于后者，进而导致DO条件改变对高SRT污泥系统的生物除磷过程及效果影响较小.
3.2 SRT和DO对污泥絮体磷形态的影响
由表 1可知，SRT为10 d污泥的TP含量在低DO和中DO条件下分别为21.68~28.53 mg · g-1(以SS计，下同)和23.01~35.85 mg · g-1，而SRT为30 d污泥的TP含量在低DO和中DO条件下分别为30.39~37.13 mg · g-1和34.65~43.40 mg · g-1.上述结果表明，高SRT(30 d)污泥的磷含量明显高于中SRT(10 d)污泥，且中DO条件的污泥较低DO条件的污泥有更高的磷含量.
表1 不同SRT和DO条件下活性污泥的TP含量
由图 3可以看出，污泥絮体中的磷主要以PO3-4-P和Poly-P的形态存在，分别为污泥TP含量的15.53%~44.91%和31.77%~64.63%，而DNA-P、Lipid-P和Protein+Residue-P仅分别为污泥TP含量的5.03%~11.91%、1.42%~3.38%和0.69%~2.76%.Poly-P包括LMW Poly-P和HMW Poly-P两种形态，LMW Poly-P为污泥TP含量的10.87%~32.85%，HMW Poly-P为污泥TP含量的19.75%~36.39%.SRT为10 d时，低DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量(以SS计)分别为8.79~10.17、2.36~5.36和4.53~7.33 mg · g-1，中DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为4.68~6.58、5.47~11.78和6.36~11.39 mg · g-1.SRT为30 d时，低DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为8.90~10.65、3.55~6.90和9.49~13.51 mg · g-1，中DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为13.94~16.06、5.41~10.00和9.15~13.97 mg · g-1.上述结果说明，高SRT(30 d)污泥的磷含量明显高于中SRT(10 d)污泥，主要源于前者较后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量，表明高SRT污泥结合磷的性能大于中SRT污泥.中SRT(10 d)下中DO污泥较低DO污泥有更高的磷含量，主要归因于前者较后者有更高的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量;而在高SRT(30 d)下中DO污泥较低DO污泥有更高的磷含量，主要归因于前者较后者有更高的PO3-4-P和LMW Poly-P含量.可以推断，污泥絮体中磷酸盐的形成同生化反应条件及生物诱导下的化学沉淀和吸附/结合作用有密切联系.
图 3 不同SRT和DO条件下污泥絮体中各形态磷含量
3.3 SRT和DO对EPS磷形态的影响
由表 2可以看出，SRT和DO对胞内磷含量(单位质量SS中细菌细胞磷含量)影响较小，而对EPS磷含量(单位质量SS中EPS磷含量)影响较大.不同SRT和DO条件下，胞内磷含量为7.02~12.30 mg · g-1，而EPS磷含量为14.66~31.10 mg · g-1.结合表 1可知，胞内磷含量占污泥TP含量的27.07%~32.38%，EPS磷含量占污泥TP含量的67.62%~72.93%，说明EPS结合了大量的磷，污泥絮体中的磷主要分布于EPS中.
表2 不同SRT和DO条件下污泥絮体的磷分布
EPS中不仅含有PO3-4-P，而且含有Poly-P和有机磷.由表 3可以看出，EPS中的磷主要以PO3-4-P和Poly-P的形态存在，分别为EPS磷含量的10.93%~44.26%和34.69%~69.02%，其中，LMW Poly-P和HMW Poly-P分别为EPS磷含量的11.78%~37.34%和22.91%~41.17%，而DNA-P、Lipid-P和Protein+Residue-P仅分别为EPS磷含量的2.79%~7.95%、0.56%~2.84%和0.05%~0.72%.SRT为10 d时，低DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为4.83~6.26、1.73~4.21和3.36~5.44 mg · g-1，中DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为2.34~4.46、4.37~9.70和4.05~8.23 mg · g-1.SRT为30 d时，低DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分别为5.77~7.44、2.73~5.22和7.78~10.91 mg · g-1，中DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P含量和HMW Poly-P含量分别为9.82~10.90、4.16~7.34和6.90~10.66 mg · g-1.上述结果说明，高SRT(30 d)污泥的EPS磷含量明显高于中SRT(10 d)污泥，主要归因于前者较后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量.这是因为SRT越大，PAOs的种群竞争优势越明显，并且PAOs具有产生EPS的基因簇，所产生EPS含有更多的磷.中SRT(10 d)下中DO污泥的EPS较低DO污泥的EPS有更高的磷含量，主要归因于前者较后者更高的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量;而在高SRT(30 d)下中DO污泥的EPS较低DO污泥的EPS有更高的磷含量，主要归因于前者较后者有更高的PO3-4-P和LMW Poly-P含量.生物强化除磷系统运行参数的短暂改变不会引起微生物主要种群结构的变化，但会改变微生物的代谢方式，因而不同DO条件下EPS磷酸盐含量和形态的差异说明EPS磷酸盐的形成受到微生物代谢活动的影响，进一步证明了EPS参与了生物聚磷过程.
表3 不同SRT和DO条件下EPS中各形态磷含量
3.4 反应过程中EPS磷酸盐含量的变化
厌氧/好氧反应过程中，EPS中的PO3-4-P与LMW Poly-P、HMW Poly-P表现出不同的变化趋势(图 4和图 5).不同SRT和DO条件下，EPS中的PO3-4-P含量(以SS计)在厌氧初期0~0.5 h迅速下降，此后无明显变化规律.SRT为10 d时，EPS的PO3-4-P在低DO和中DO条件下的厌氧降低量分别为1.24 mg · g-1和2.12 mg · g-1，好氧反应阶段分别降低了0.20 mg · g-1和升高了0.50 mg · g-1.SRT为30 d时，EPS的PO3-4-P在低DO和中DO条件下的厌氧降低量分别为0.47 mg · g-1和0.17 mg · g-1，好氧反应阶段分别降低了1.20 mg · g-1和0.91 mg · g-1.
图 4 图 4 1#反应器污泥EPS中不同形态磷酸盐含量的变化
图 5 2#反应器污泥EPS中不同形态磷酸盐含量的变化
由图 4可知，EPS中LMW Poly-P和HMW Poly-P含量呈现出明显的厌氧降低和好氧升高的变化趋势.SRT为10 d时，低DO条件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量在厌氧初期降低较缓慢，0~0.5 h分别降低了0.01 mg · g-1和0.61 mg · g-1，中DO条件下两者在厌氧初期的降低量增大，0~0.5 h分别降低了0.52 mg · g-1和2.06 mg · g-1;低DO条件下其LMW Poly-P和HMW Poly-P含量在好氧初期快速升高，4~5 h分别升高了0.56 mg · g-1和1.16 mg · g-1，中DO条件下两者在4~5 h分别升高了1.81 mg · g -1和1.14 mg · g-1.SRT为30 d时，EPS的LMW Poly-P含量在低DO和中DO条件下均表现为厌氧初期快速降低，0~1 h分别降低了0.97 mg · g-1和1.55 mg · g-1，好氧初期迅速升高，4~5 h分别升高了0.72 mg · g-1和1.10 mg · g-1;其HMW Poly-P在低DO和中DO条件下较LMW Poly-P表现为厌氧初期缓慢降低，0~1 h分别降低了0.59 mg · g-1和0.88 mg · g-1，好氧初期亦迅速升高，4~5 h分别升高了0.97 mg · g-1和0.76 mg · g-1.上述结果说明，中SRT(10 d)污泥EPS和高SRT(30 d)污泥EPS的Poly-P在厌氧初期的分解分别主要源自HMW Poly-P和LMW Poly-P;低DO条件和中DO条件下好氧初期合成的EPS Poly-P分别主要为HMW Poly-P和LMW Poly-P.不同SRT和DO条件下EPS中LMW Poly-P和HMW Poly-P厌氧分解和好氧合成过程的差异，说明EPS磷酸盐的形成与转化同微生物代谢活性、代谢方式和种群结构有密切联系.
4 讨论
4.1 EPS在生物除磷中的作用大小
生物除磷是细菌细胞和EPS共同作用的结果.由图 6可以看出，污泥絮体的厌氧释磷和好氧吸磷过程主要源自EPS磷含量的厌氧降低和好氧升高，EPS磷的厌氧降低量和好氧升高量为胞内磷变化量的2.8~6.4倍.厌氧/好氧反应过程中，中SRT(10 d)污泥EPS在低DO和中DO条件下的除磷量分别为2.83 mg · g-1和4.91 mg · g-1，分别占污泥絮体除磷量的71.65%和70.55%;高SRT(30 d)污泥EPS在低DO和中DO条件下的除磷量分别为2.94 mg · g-1和3.09 mg · g-1，分别占污泥絮体除磷量的71.71%和71.86%，说明EPS对生物除磷作用有重要影响.中SRT(10 d)污泥EPS磷的厌氧降低量和好氧升高量大于高SRT(30 d)污泥，且中DO污泥EPS磷的厌氧降低量和好氧升高量大于低DO污泥的EPS;与中SRT(10 d)污泥EPS相比，DO改变对高SRT(30 d)污泥EPS磷变化量的影响较小，进而导致DO改变对高SRT(30 d)污泥系统的生物除磷效果影响较小.
图 6 厌氧/好氧反应过程胞内磷和EPS磷的变化量
采用超声波-树脂法提取不同进水C/P比A/O-SBR反应器活性污泥的EPS，结果表明，EPS除磷量占系统除磷量的60%~62%，与本文研究结果接近.周健等和Li等采用阳离子交换树脂法分别提取不同A/O-SBR反应器活性污泥的EPS，前者认为EPS的除磷量占系统除磷量的15.7%，后者认为EPS的除磷量占系统除磷量的4.2%~13%，与本文研究结果差异较大.超声波-树脂法是高效的EPS提取方法，其低频、低功率超声波能有效分散污泥絮体，促进后续离子交换反应，具有化学污染小、细胞破损率低的优点，且较阳离子交换树脂法能更为高效地提取EPS.因此，相关研究结论存在明显差异不仅与污泥样品的来源有关，而且与EPS提取方法的不同有密切联系.另一方面，EPS主要来源于微生物细菌的代谢分泌物和自溶产物，合成EPS是微生物细菌重要的生存、竞争策略;PAOs(包括反硝化聚磷菌)是一类具有超量摄磷功能的微生物，与其它微生物存在复杂的共生/互生关系，目前仍无法培养出PAOs的纯菌群.可以推断，PAOs与其它微生物通过EPS合成方式的改变建立共生/互生关系，促使EPS吸附/结合大量的磷，是PAOs超量释磷/摄磷的重要途径.
4.2 EPS磷酸盐形态对生物除磷过程的影响
EPS磷酸盐可分为PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P 3种形态，EPS磷酸盐的形态对EPS除磷过程有重要影响.生物除磷过程中EPS的PO3-4-P含量变化涉及PO3-4-P和Poly-P之间的转化及主体液相与EPS之间PO3-4-P的迁移两方面.由图 4和图 5可知，相对于11 h污泥的EPS，0 h时污泥EPS的PO3-4-P含量均较高，而LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均较低，可以推断，沉淀过程中EPS的Poly-P发生了分解，并以PO3-4-P的形式滞留于EPS中;厌氧初期，在搅拌混合作用下沉淀过程滞留于EPS的PO3-4-P迅速迁移至主体液相，导致EPS的PO3-4-P含量在0~0.5 h迅速降低，这是厌氧初期污泥絮体快速释磷的重要原因之一;此后，EPS的PO3-4-P含量无明显变化规律，主要因为PO3-4-P和Poly-P之间的转化速率及主体液相与EPS之间PO3-4-P的迁移速率在反应过程中发生了动态变化.EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均表现厌氧降低和好氧升高的变化规律.由图 7可知，对于相同SRT的污泥，中DO条件较低DO条件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P有更大的厌氧降低量和好氧升高量，对应着更明显的生物除磷过程(图 2).高SRT(30 d)污泥EPS的Poly-P(LMW Poly-P和HMW Poly-P)在中DO条件的好氧升高量为低DO条件的1.2倍，而中SRT(10 d)污泥EPS的Poly-P在中DO条件的好氧升高量为低DO条件的2.1倍，从而表现出DO浓度的变化对高SRT(30 d)污泥系统的生物除磷过程及效果影响较小的现象.厌氧/好氧反应过程中，EPS不同形态磷酸盐含量的动态变化说明EPS不仅是生物除磷过程的中转站，而且参与了生物聚磷过程.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
图 7 厌氧/好氧反应过程EPS中不同形态Poly-P的变化量
5 结论
1)污泥絮体中的磷主要分布于EPS中，PO3-4-P和Poly-P(包括LMW Poly-P和HMW Poly-P)是EPS磷的主要形态.高SRT(30 d)污泥的EPS磷含量明显高于中SRT(10 d)污泥，主要归因于前者较后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量;厌氧/好氧反应过程中，EPS的PO3-4-P与LMW Poly-P、HMW Poly-P表现出不同的变化趋势.
2)EPS对生物除磷的影响明显大于细菌细胞.污泥絮体的厌氧释磷和好氧吸磷过程主要源自EPS磷含量的厌氧降低和好氧升高，EPS磷的厌氧降低量和好氧升高量为胞内磷变化量的2.8~6.4倍.
3)EPS不仅是生物除磷过程的中转站，而且参与了生物聚磷过程.EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均表现厌氧降低和好氧升高的变化规律;对于相同SRT的污泥，中DO(2.5~3.5 mg · L-1)条件较低DO(0.7~1.0 mg · L-1)条件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P有更大的厌氧降低量和好氧升高量，对应着更明显的生物除磷过程.