1 引言
近年来，由于化纤织物的发展和印染后整理技术的进步，使大量PVA浆料、新型助剂等难生化降解的有机物进入印染废水，这给生化处理增加了难度.而水解酸化的目的是针对印染废水中这类可生化性很差的一些高分子物质，期望它们在厌氧段转化为小分子物质，从而改善废水的可生化性，为后续处理创造条件.
UASB反应器(Up-flow Anaerobic Sludge Blanket)作为第二代废水厌氧生物处理的典型工艺，具有结构紧凑、处理能力大(有机负荷高)、无机械搅拌装置、处理效果好及占地小等优点，与传统的厌氧生物处理工艺相比，实现了水力停留时间(HRT)与污泥停留时间(SRT)的有效分离，是目前研究较多、应用日趋广泛的新型废水厌氧处理设备.
为此，某印染废水处理厂采用UASB作为水解酸化池，稳定运行后发现其不仅具有传统水解酸化的作用，废水通过UASB还具有脱氮效能且排泥量很少，2012年每吨水的污泥产量仅为376 g(含水率80%)，大大小于奚旦立等研究发现的4000 g · t-1(含水率80%)的平均水平.为阐明该UASB如何脱氮并实现低污泥产量，本研究利用454高通量测序技术对UASB中水解酸化污泥进行微生物的菌群结构分析，以期从微观方面解释这种现象并为以后此类废水的处理提供参考.
2 材料与方法
2.1 工艺概况
江苏某工业园区污水处理厂以处理印染废水为主，约占总处理水量90%以上，处理水量约为12000 m3 · d-1左右，采用“UASB +好氧池+接触氧化池”为主体的二级生化处理工艺.经多年的实际运行，大量监测数据表明，该工艺处理效果良好，出水水质达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918—2002)一级A标准.2010—2012年污水处理厂进出水水质情况如表 1所示，工艺流程见图 1.
表1 2010—2012年污水处理厂进出水水质情况
图 1 工艺流程图
2.2 水解酸化
通过投加稀硫酸调节废水的pH值，使后续生化反应池内的微生物在正常环境下生存，以保证衔接工序高效稳定地运行.UASB可降解部分有机污染物、截流与消化回流剩余污泥和SS，减小后续处理的有机负荷.
UASB反应池的外形尺寸为16 m×16 m×14 m(长×宽×高)，为钢筋混凝土结构，共2座，有效水深8.5 m，三相分离区3.0 m，布水区1.5 m，超高0.5 m，水力停留时间8.0 h.系统稳定运行后，废水通过UASB反应池，其污染物的去除率如表 2所示.
表2 UASB中污染物去除率
2.3 实验方法
污泥样品取自于现场稳定运行的UASB中，用无菌采样袋装盛并密封带回实验室，利用实时荧光定量PCR并委托上海欧易公司采用454高通量测序技术对污泥样品的微生物群落进行分析，实验流程如下.
2.3.1 DNA提取
使用OMEGA 公司的E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性.
2.3.2 PCR扩增
按指定测序区域，合成带有5′454 A、B接头-特异引物3′的融合引物，PCR采用TransGen TransStart Fastpfu DNA Polymerase AP221-02，PCR仪为ABI GeneAmp 9700 型;每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用 2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测.
2.3.3 荧光定量
参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合. emPCR和Roche Genome Sequencer FLX +上机测序所用试剂分别为Roche GS FLX Titanium emPCR Kits(Lib-L)和Roche GS FLX+ Sequencing Method Manual_XLR70 kit.
2.3.4 生物信息学分析
去除序列末端的后引物和接头序列、多碱基N、poly A/T尾巴及低质量碱基;去除所得序列的barcode标签序列、前引物序列;丢弃长度短于200 bp、模糊碱基数>0、序列平均质量低于25的序列;提取非重复序列，与Silva数据库(http://www.arb-silva.de/)中已比对的(16S/18S，SSU)核糖体序列数据进行比对，去杂后生成分类操作单元;采用Mothur(http://www.mothur.org/wiki/Classify.seqs)软件将OTU中全部序列与Silva数据库进行比对，找出最相近且可信度达80%以上的种属信息.为了获得每个 OTU 的分类学信息，将 97%相似水平下每个 OTU 中的所有序列进行一致性分析，找出同一个 OTU 中的不同序列的最近祖先的种属信息作为该 OTU 的种属信息.
3 结果与分析
3.1 微生物群落的多样性分析
3.1.1 微生物的丰度和多样性指数
通过对Chao指数(http://www.mothur.org/wiki/Chao)和Ace指数(http://www.mothur.org/wiki/Ace)的计算可以统计出UASB中微生物群落的丰度估计，结果见表 3.通过对Shannon指数(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)和Simpson指数(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)指数的计算可以统计出UASB中的微生物群落的多样性估计，结果见表 4.
式中，Schao1为估计的OTU数，即Chao指数;Sobs为实际观测到的OTU数;N1为只含有一条序列的OTU数目;N2为只含有两条序列的OTU数目;SACE 为ACE指数;Srare为含有少于10条(包含10条)序列的OUT数目;Sabund为含有多于10条序列的OUT数目;abund为“优势”OUT的阀值，默认为10;Ni为含有i条序列的OUT数目;Dsimpson为Simpson指数;Hshannon 为Shannon指数;N为所有的序列数.
表3 样品的丰度估计量
表4 样品的多样性估计量
Boon等研究发现，生活废水、造纸废水、印染废水的菌群Shannon指数分别为2.70、2.68、 2.45.Miura等对城市污水的细菌群落结构进行了研究，其Shannon指数在3.25~4.00之间.因此，从表 3和表 4可见，该印染废水处理系统中细菌具有较高多样性，同时，根据生态学中的多样性导致稳定性原理，UASB反应器中的微生物菌种呈多样性分布有利于稳定产酸，并为后续微生物提供丰富的有效碳源.
3.1.2 Good′s Coverage指数和稀释性曲线
通过Good′s Coverage指数(http://www.mothur.org/wiki/Coverage)的计算(公式(9))结果可以看出，样品的Good′s Coverage指数都较高(表 5)，表示样品中序列被测出的概率较高.从图 2可以看出，样品的稀释性曲线已经渐渐趋向较平坦，证明此次测序的数据量是合理的，继续测序不会再产生较多新的OTU.
式中，N1 为只含有一条序列的OUT数目，N为抽样中出现的总序列数目.
表5 Good′s Coverage指数计算结果
图 2 样品稀释性曲线
3.2 测序结果
样品有效序列和优化序列分别为11707和8491，通过分类学分析，UASB中微生物共有435种，在门的分布比例主要为变形菌门30.36%，拟杆菌门25.59%、绿弯菌门19.34%、厚壁菌门12.35%、互养菌门6.46%、螺旋体门1.58%和浮霉菌门1.15%等.
通过454高通量测序，在属的水平上的优势菌群组成鉴定结果如表 6所示.可以看出，在UASB反应池的优势菌属中并未发现含有产甲烷菌，说明厌氧消化很好地停留在了水解酸化阶段.
表6 优势菌属及其比例
任南琪等研究发现，脱硫橄榄样菌属(Desulfobacula)属于δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)，可氧化各种芳香族化合物(包括芳香族硫氢甲苯)为CO2，它在缺氧的环境中可以利用硫酸盐和硫作为电子受体并以有机化合物作为电子供体，属于完全氧化型SRB(Sulfate-reducing bacteria)，可以通过TCA途径或乙酰辅酶A途径将乙酸反向氧化至CO2和H2O.杆状脱硫菌属(Desulforhabdus)也是属于δ变形杆菌纲(Deltaproteobacteria)的硫酸盐还原菌，可利用脂肪酸并将其完全氧化成CO2.
Levilinea和长绳菌属(Longilinea)同属于绿弯菌门的厌氧绳菌纲(Anaerolineae)，目前对它们的研究较少.曹新垲等对工业废水中的萘进行高效生物处理时发现，微生物群落中含有Levilinea和Longilinea，证明此两种属菌类对于染料中的萘有一定的去除作用.Thauera属细菌是β变形菌纲(Betaproteobacteria)下的一类革兰氏阴性细菌，大都为杆状且具有反硝化能力.广泛存在于各种类型的废水处理装置中并具有多种芳香族污染物降解能力的重要功能类群且已知的Thauera属细菌则都是反硝化菌.
Paludibacter属于拟杆菌门的紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)，为中温厌氧型且能发酵多种单糖和二糖产丙酸、乙酸和少量丁酸.Tepidimicrobium属于梭菌纲(Clostridia)的梭菌科(Clostridiaceae)，Slobodkin等发现它中度嗜热，属于厌氧细菌;Phitsuwan等发现它能够分解纤维素和木聚糖.类芽孢杆菌(Paenibacillus)的细胞呈杆状，能从各种糖上产酸，有的种还能够分解不同的多糖.李欣等某污水处理厂活性污泥采用双层平板基内培养法筛选得到一株兼性产淀粉酶菌株，经过鉴定为类芽胞杆菌属.
梭菌属(Clostridium)属于厚壁菌门(Firmicutes)，Rhee等将剩余污泥用厚壁菌门(Firmicutes)的梭菌属(Clostridium)进行发酵，可以实现污泥减量化和挥发酸的生产，是UASB中起到产酸和污泥减量作用的主要菌种之一.
从表 2中可以看出，印染废水通过UASB反应池，B/C可以从进水时的0.30提高到0.42，SS和色度去除率分别达到70%和76%，并且在此印染废水处理工艺中，废水通过UASB反应池，NH+4-N与TN也有33%和40%左右的去除效率.这是因为在前端投加了稀H2SO4调节pH，UASB中硫酸盐抑制了产甲烷菌的生长，使整个反应器更好地停留在了水解酸化阶段，脱硫橄榄样菌属(Desulfobacula)和杆状脱硫菌属(Desulforhabdus)能够氧化废水中的乙酸、芳香族等有机物为CO2并将SO2-4还原成S2-;Paludibacter、 Tepidimicrobium、Paenibacillus能够分解废水中的多糖等物质，Levilinea和长绳菌属(Longilinea)能够去除染料中的萘，Thauera属能够去除印染废水中所含的少量芳香烃污染物.梭菌属(Clostridium)可能是此印染废水具有低污泥产量的主要原因.
不可忽视的是，氨氮在通过UASB后有一定程度的去除，在门的水平下浮霉菌门占1.15%，且厌氧的浮霉菌门大部分都为厌氧氨氧化菌，由此可以推测出是通过厌氧氨氧化作用来去除的.但进水中硝酸盐与亚硝酸盐的含量很低，且通过高通量测序在属的水平上并未发现目前已知的几种以亚硝酸盐为电子受体的厌氧氨氧化菌，如C and idatus Brocadia、C and idatus Kuenenia、C and idatus Scalindua、C and idatus Jettenia等.因此，可能发生的是硫酸盐型厌氧氨氧化反应，能够以氨为电子供体，以硫酸盐为电子受体，将两种基质转化为氮气和单质硫.虽然目前对硫酸盐型厌氧氨氧化的研究较少，并不能确定到种属的水平上，但我们可以推测在进水无硝态氮与亚硝态氮的情况下，稀硫酸的存在可以发生硫酸盐型厌氧氨氧化从而去除进水中的部分氨氮.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
4 结论
1)本研究采用454高通量测序技术，对运行期间的UASB水解酸化污泥中微生物菌群进行分析，从而得知在UASB反应池中的优势微生物种属，通过菌群鉴定发现：Desulfobacula、Levilinea、Longilinea、C and idatus Tammella、Paludibacter、Thauera、Tepidimicrobium、Desulforhabdus、Paenibacillus、Clostridium是主要的优势菌属，梭菌属(Clostridium)主要起到污泥减量和产酸的作用，氨氮降低的原因则与硫酸盐型厌氧氨氧化作用有关.
2)通过前端投加稀H2SO4来调节进水的pH，不仅可以在厌氧消化阶段抑制产甲烷菌使其更好地停留在水解酸化阶段，且对含有氨氮而不含硝态氮与亚硝态氮的废水可以通过硫酸盐型厌氧氨氧化反应来去除氨氮，这对此类废水的处理具有一定的参考价值.
3)通过Shannon等指数的计算可以看出，该UASB反应器较其他废水处理系统的微生物菌群多样性较高，有利于稳定产酸，并为后续微生物提供丰富的有效碳源.