发光细菌法作为一种灵敏、 快速、 廉价的生物检测手段，普遍应用于生物毒性的测定. 发光细菌受到有害物质干扰时，发光代谢受到影响，根据有害物质的种类与浓度不同，菌体发光强弱程度不同，据此以监测有害物质的毒性[1]. 早在20世纪30年代，发光细菌首先用于快速评价药物的毒性作用[2]. 随着对发光细菌的认识和理解的深入，这种毒性评价技术逐渐发展成熟，已成功用于研究苯酚衍生物和硝基苯[3]、 五氯酚钠[4]、 水环境中金属[1]、 土壤中有机污染物2,4,6-三硝基甲苯[5]、 农药[6]等多种物质的毒性，该法对生物毒性效应具有很好的指示作用，现已成为一种国际通用的标准毒性评价手段. 早期研究发现，污染物的浓度与发光细菌的发光度呈一定的线性关系，但随着科学的发展，越来越多的研究显示，利用Sigmoidal模型、 Weibull 或Logit 模型等拟合出的“S”型曲线能够有效地描述污染物的毒性，较线性拟合更加符合毒物与发光细菌作用的剂量-效应关系[7, 8]. 目前，国内对应用发光细菌法评价工业废水毒性的报道较少. 张秀君等[9]在对造纸、 冶炼、 化工、 采矿等行业的废水进行急性毒性监测时，指出发光细菌法可以较好地评价工业废水的毒性. 胡莉莉[10]利用发光细菌试验测试了122种工业废水得出结论，对于COD较高而成分未知的有机废水，利用发光细菌检测方法可以较好地评价其对生物的毒害效应. 那广水等[11]利用发光细菌法评价了排污口污水中总有机污染物的毒性作用后，明确指出，该法对工业废水中的总有机污染物毒性的评价是准确和全面的. 而对于制药废水利用发光细菌法进行综合生物毒性评价，国内的研究更为少见. 李专等[12]曾利用淡水发光菌对多个制药厂排水进行综合生物毒性研究，给出了毒性强弱程度排序，并分析了不同制药厂排水与水体COD之间的关系，指出不同制药厂排水对发光细菌的毒性与水体COD并无相关性. 刘锐等[13]利用明亮发光杆菌T3小种对维生素制药各工段排水进行了毒性评价， 得到相应水样的半数抑制浓度，并对TOC与水样毒性进行相关分析，最终给出了排水处理工艺的优化建议. 季军远等[14]利用明亮发光杆菌T3小种对制药废水中可能包含的4类抗生素和厌氧消化中间产物进行了毒性评价，得到氨苄青霉素、 林可霉素、 卡那霉素和环丙沙星的半数抑制浓度依次为3.99、 5.11、 4.32和5.63 g ·L-1，厌氧消化中间产物乙醇、 乙酸、 丙酸、 丁酸的半数抑制浓度依次为19.40、 20.71、 10.47和12.17 g ·L-1. 一些发达国家从20世纪70年代起，已经开始利用发光细菌等生物，对排放废水进行生物毒性评价，并制定相关的排放标准[15]. 在此期间，美国结合半数抑制浓度EC50，提出了废水急性毒性的评价指标单位TUa(acute toxic unit)[16]，TUa与EC50在数值上的关系为TUa=100/EC50. 目前，发光细菌法已成功应用于医院[17]、 电镀[18]等行业的废水毒性评价. 欧洲在2000年前后提出了最低无效应稀释度LID(lowest ineflective dilution)[19]，规定为没有观察到抑制作用的最大浓度组的稀释倍数值，或者是只观察到不超过特定测试方法变异性效应的最大浓度组的稀释倍数值. 它是用于排放废水管理的毒理学新概念，直观地描述了有毒的废水对受试生物不产生毒害效应所需的稀释倍数. 本研究利用发光细菌急性毒性评价制药废水在污水处理过程中的毒性削减过程，结合EC50、 LID和TUa，评价不同处理阶段废水的生物毒性，以期为利用生物毒性评价制药工业废水提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 水样来源
本试验水样来自某抗生素制药厂2012年8月的废水处理站废水，该厂废水font>的处理工艺为接触氧化法. 选取5个采样点分别为： ①地下调节池、 ②地上调节池、 ③中间沉淀池、 ④二级沉淀池和⑤总出水排放口，采集废水处理工艺构筑物中的废水. 废水处理工艺流程和采样点如图 1所示.
图 1 各采样点在处理工艺中的分布情况
1.2 发光细菌
明亮发光杆菌T3小种(Photobacterium phosphorem T3 spp.)，属于海洋发光细菌，购自中国科学院南京土壤研究所.
1.3 主要试剂与仪器
氯化钠(NaCl，化学纯).
冰点渗透压仪，DXY-2型生物毒性测定仪，真空过滤泵，玻璃滤器，保温箱，4 L玻璃膜口瓶，封口膜，玻璃纤维素膜等.
1.4 样品处理
水样经玻璃纤维素膜，去除大颗粒杂质. 按照1.45 g ·(100 mL)-1废水比例添加氯化钠，相当于3 g ·(100 mL)-1氯化钠溶液的冰点渗透压，以保证明亮发光杆菌T3小种细胞所需的渗透压，避免渗透压对试验结果产生影响.
1.5 发光细菌试验
利用明亮发光杆菌冻干粉进行废水不同样品不同浓度的急性毒性研究. 样品浓度设置参照ISO 11348-3[20]的方法交叉等级稀释，设置2个平行. 操作步骤严格参照《水质-急性毒性的测定-发光细菌法》(GB/T 15441-1995)进行，并根据要求，利用HgCl2对本研究所用发光细菌进行敏感性评价[21].
根据空白样品的发光量L0和样品的发光量Li，计算样品的相对发光度Ii，即：
利用Origin 7.5软件绘制样品浓度与发光细菌相对发光度的关系曲线图.
1.6 毒性评价
Coleman等[22]根据样品浓度和发光细菌的发光度值EC50之间的关系，将受试物毒性进行分级，如表 1所示.
表 1 受试物毒性等级
表 2 工业废水生物毒性分级
2 结果与讨论
2.1 废水水质分析
根据该废水处理厂常年检测结果的统计数据，合成废水的COD值较高，平均为26 721 mg ·L-1，流量较小，为39 m3 ·d-1，氨氮含量较高，为1 760 mg ·L-1; 综合废水COD值较低，平均为4 006 mg ·L-1，流量较大，为1 833 m3 ·d-1，氨氮含量较低，为21 mg ·L-1. 该废水处理厂水中含有大量的抗生素和有机物，具有生物降解难、 有机物含量高等特点. 本研究为随机采样，采样点废水pH、 COD等常规理化指标测定结果如表 3所示.
表 3 采样点废水的理化数据 1)
2.2 地下调节池水样分析
地下调节池是废水处理工艺的第一段工艺，调节制药厂瞬时综合废水的流量，即1号水样. 如图 2所示，此处废水毒性较大，浓度为100%时，发光细菌的相对发光度为19.41%. 废水毒性作用范围较宽，浓度稀释至0.07%时，相对发光度为103.90%. 通过计算可知，该段废水的EC50=3.44%，TUa=29，LID=625. 该工艺的废水主要是制药废水，其中抗生素含量较高，对发光细菌的毒性较大，故得出的最低无效应稀释度较大. 本研究所用菌种HgCl2的EC50=0.10 mg ·L-1，符合国标中试验菌种的敏感性要求[21].
图 2 1号水样不同浓度的发光细菌相对发光度
2.3 地上调节池水样分析
地上调节池是废水处理工艺的第二段流程，收纳了经过地下调节池处理并沉淀后的废水和一部分合成废水，即2号水样. 如图 3所示，该处的废水毒性较1号水样毒性更大，废水浓度为100%时，相对发光度仅为10.78%. 毒性作用范围较1号水样更加宽泛，在浓度为0.03%时，相对发光度为101.30%. 通过计算可知，该段废水EC50=2.46%，TUa=41，LID=244. 比较1号和2号水样的毒性数据可知，根据EC50鉴别废水的毒性，2号水样的生物毒性略高于1号，与理化指标中COD反映的现象一致. 由于地上调节池中混入了合成废水，污染物成分更加复杂，有可能产生联合毒性效应，对发光细菌的影响更为明显，毒性抑制作用更大. 从图 3中亦可看出，此段废水在0.07%和0.16%浓度点，发光细菌的相对发光度均明显高出最低浓度. 该现象推测是在一定的低浓度范围内，毒性物质与发光细菌相互作用时，具有一定的刺激效应，促使发光量增大，即低剂量兴奋作用; 或者是由于废水中含有一定的营养物质，在毒性很低的情况下，营养物质促进了发光细菌的活动，导致发光亮增大. 在唐景春等[25]的研究中也出现了相同的情况，他们认为可能是由于一些污水中含有可被微生物利用的营养物质，这些物质的存在促进了发光菌的发光活性. 对于这种促进作用，目前没有研究给出具体的、 确切的解释，有待日后继续深入探讨.
图 3 2号水样不同浓度的发光细菌相对发光度
2.4 中间沉淀池水样分析
地上调节池的废水经过一级好氧处理后进入中间沉淀池，即3号水样. 如图 4所示，在浓度为100%时，发光细菌的相对发光度已经高于50%，达到66.60%. 此时的水样EC50>100%，但由于仍具有一定的毒性，故可获得最低无效应稀释度，即LID=10. 经过好氧生物处理，3号水样的COD去除率达到93%，其中的有机污染物被微生物氧化分解，水质的毒性有了大幅度的削减，对发光细菌的抑制作用已经明显减弱，相对发光度明显高于1、 2号，但并不是完全无毒性. 该沉淀池的好氧处理过程虽然能处理部分悬浮物质，但残留的有机污染物仍然对发光细菌造成了一定的抑制作用[26].
图 4 3号水样不同浓度的发光细菌相对发光度
2.5 二级沉淀池水样分析
中间沉淀池的废水经过A/O池处理后，进入二级沉淀池，即4号水样. 如图 5所示，该水样作用的发光细菌相对发光度均在100%附近，且绝大部分高于100%. 说明此段的废水对发光细菌已无明显的抑制效应. 因此，4号水样对发光细菌作用的EC50>100%，LID=1，且100%浓度废水的发光细菌相对发光度为109.90%. A/O法结合前段缺氧和后段好氧处理，降解有机污染物，并具有一定的脱氮除磷功能，提高污水的可生化性及氧化效率，结合反硝化作用完成C、 N、 O在生态中的循环，实现污水无害化处理. 因此，从LID的测试结果可以看出，经过A/O工艺处理，完全去除了水质对发光细菌的毒性抑制作用.
图 5 4号水样不同浓度的发光细菌相对发光度
2.6 最终排出口水样分析
二级沉淀池的水经过絮凝沉淀池的再沉淀作用后，最终从污水处理厂的排水口排出，即5号水样. 如图 6所示，该水样对发光细菌的影响保持与4号水样相同的趋势， 5号水样的EC50>100%，LID=1. 从数据和图形可见，100%浓度下的发光细菌相对发光度为103.70%，明显高于《混装制剂类制药工业水污染物排放标准》(GB 21908-2008)中规定的发光细菌急性毒性标准限值，即HgCl2浓度为0.07 mg ·L-1时相对应的发光细菌相对发光度75.25%，故总出水排放口水样已经达到排放标准[27].
图 6 5号水样不同浓度的发光细菌相对发光度
2.7 水样COD值与发光细菌相对发光度的关系
对各采样点水样的COD值与100%浓度下对应的发光细菌相对发光度进行比较. 相对发光度以I表示. 具体情况见表 4.
表 4 废水COD值与发光细菌的相对发光度
从表4中可知，在一定情况下，随着COD的降低，发光细菌的相对发光度逐渐升高. 对两组数据进行拟合，发现相对发光度与COD值、 lg(COD)具有一定的线性关系，拟合公式分别为式(2)和式(3)：
式中，Y为发光细菌相对发光度，X1和X2分别为COD和lg(COD)值，公式(2) R2=0.869 6，公式(3) R2=0.941 2. 根据R2值可知，相对发光度与lg(COD)值的线性关系较好.
3 问题与建议
(1)在废水处理工艺中增加生物毒性指标，对监测废水中的污染物毒性具有良好的指示作用，但是目前我国对相关领域的研究和应用还不能构成体系.
(2)发光细菌在指示工业废水毒性时，受废水中物质成分的影响. 对于发光量不被抑制反被促进的现象还有待进一步研究.
(3)本研究仅针对于该厂夏季废水处理工艺效果，鉴于季节差异对该废水处理工艺的影响较大，故其他季节的废水处理能力有待进一步研究.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
4 结论
(1)污水处理工艺节点所取1～5号水样对发光细菌的毒性逐渐减弱，最终排出口对发光细菌无可见毒性抑制作用，现有废水处理工艺在夏季能够有效地降低制药废水的生物毒性.
(2)发光细菌的相对发光度与水样lg(COD)值之间线性相关性较好，对同一生产阶段制药废水COD的变化具有一定的指示作用.
(3)在较低的浓度范围内，废水对发光细菌的发光反应具有促进作用，增大发光细菌的相对发光度.