石化废水是石化工业在生产各种石油产品和有机化工材料过程中产生的废水. 石化废水污染物种类多、 成分复杂、 水质水量波动大. 废水中含有石油类、 苯和苯的衍生物等多种毒性有机物，属于难降解的工业废水[1]. 单一的处理工艺很难达到要求，常采用物化法预处理，厌氧/好氧生化法二级处理，有些石化企业为达到更高的排放标准或实现回用还设有深度处理工艺[2, 3]. 其主体工艺为以活性污泥法、 缺氧/好氧(A/O)、 生物流化床等为代表的二级生化处理工艺[4].
A/O工艺具有较高的有机物降解和脱氮能力，并且基建和运行费用低，近年来在国内外发展迅速. 溶解氧是O段需要控制的重要指标. 曝气费用一般占污水运行费用的60%~80%，溶解氧过高会造成能量的浪费，而且影响总氮的去除[5]. 较低的溶解氧会抑制好氧菌的活性，影响有机物的降解和硝化作用[6]. 吴昌永等[7]研究采用A2/O工艺处理生活污水，当O段溶解氧(DO)浓度从4.0 mg ·L-1降到1.0 mg ·L-1时，COD的去除率一直保持在较高的水平，但系统硝化效果降低. Guo等[8]研究表明较低的DO水平(1.5~2.4 mg ·L-1)有利于A/O生物膜反应器的快速启动，而且抗冲击负荷能力强.
目前关于DO影响的研究大多针对生活污水，对处理实际石化废水的研究十分有限; 并且缺乏DO对反应器微生物群落结构和代谢机制的影响研究. 传统的分子生物学方法操作繁琐复杂，得到的信息量有限. Rocher 454测序[9]是一种基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序技术，具有测序速度快、 读长长、 通量高、 准确度高和一致性好等优点. 它不仅可以获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化，而且可进行种群多样性和丰度分析[10].
本文以实际石化废水为处理对象，研究DO浓度对A/O反应器降解有机物和脱氮除磷效果的影响; 并解析不同DO浓度下微生物的群落特征，以期为A/O工艺运行调控提供技术基础.
1 材料与方法
1.1 实验装置
实验装置如图 1所示. 废水经蠕动泵进入A/O反应器，出水经沉淀池沉降后从顶部溢流堰排出，沉淀池底部的污泥经蠕动泵回流至缺氧A段. 反应器由有机玻璃制成，分为平行运行的A、 B两组. 每组由一个A段和两个好氧段O1、 O2组成，总体积为45 L，A段、 O1段和O2段的比例为1 ∶2 ∶2，沉淀池体积为28 L. 反应器在A段设有机械搅拌，O段采用底部砂棒曝气. A组反应器O段的DO控制在2~3 mg ·L-1，B组反应器控制在5~6 mg ·L-1，反应器温度为23~26℃.
图 1 实验装置示意
1.2 实验用水和启动、 运行方案
实验装置建在我国北方某石化综合污水处理厂内. 该污水厂的进水由工业废水和生活污水两部分构成，比例约为3 ∶1. 工业废水来源于该公司下属的炼油厂、 化肥厂、 电石厂、 树脂厂等所有化工厂处理后的出水. 实验用水取自该污水厂的水解酸化池出水，水质指标如表 1所示. 进水COD波动较大，总氮(TN)主要以氨氮为主，总磷(TP)含量比较低.
表 1 实验废水水质 1)
接种污泥取自该污水厂的曝气池. 反应器自2013年4月24日启动，闷曝48 h后开始连续进水. 水力停留时间(HRT)为30 h，回流比为100%. 经过两周左右的驯化，出水水质稳定，COD去除率达到70%以上，反应器启动成功. 反应器稳定运行分两个阶段：自2013月5月20日至2013年9月4日，HRT为30 h; 自2013年9月5日至2013年11月6日，HRT为20 h. 污泥龄(SRT)为50 d.
定期(每隔2~3 d)取样测定反应器进水、 出水的COD和氨氮浓度. 不定期检测进、 出水BOD5、 TN、 TP浓度和反应器各段COD和氮化合物的浓度分布. 所有水样均采用0.45 μm滤膜过滤后再进行分析. 反应器运行稳定后，取两组O段污泥样品进行微生物种群结构解析. 对反应器进、 出水进行溶解性微生物产物(SMP)、 蛋白质、 多糖和腐殖酸含量以及3D-EEM荧光光谱检测分析其水质特性的变化规律.
1.3 分析方法
BOD5、 COD、 氨氮、 硝氮、 亚硝氮和总磷测定均参照国标方法测定[11]. 总有机碳(TOC)和TN使用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN,岛津)测定. 多糖测定采用苯酚硫酸法，蛋白采用考马斯亮蓝法. 污泥浓度(MLSS)采用重量法测定. DO和水温采用便携式溶解氧测定仪(YSI-550A). 采用3D-EEM荧光光度计(Hitachi F-7000)分析出水溶解性有机物质的组成[12]，激发波长(Ex)为200~400 nm，发射波长(Em)为240~500 nm，狭缝宽度5 nm，扫描速度1 200 nm ·min-1，光电倍增管PMT电压700 V.
微生物种群分析采用454高通量测序法，具体实验方法如下.
1.3.1 DNA提取与纯化
生物膜样品的DNA采用E.Z.N.A.土壤DNA提取试剂盒(OMEGA公司)进行提取，实验按照生产厂商提供的方法进行.
1.3.2 PCR扩增
DNA样品采用16S rRNA通用引物(27F和533R)对细菌的V1～V3区域进行扩增. 前向引物(5′-GCC TTG CCA GCC CGC TCA GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′)包含454B衔接子序列和细菌通用引物27F序列. 反向引物(5′-GCC TCC CTC GCG CCA TCA GNN NNN NNN NNT TAC CGC GGC TGC TGG CAC-3′)包含454A衔接子序列，随机组合的10个碱基标记每一种PCR产物和细菌通用引物533R序列. PCR反应于20 μL体系中进行，包含0.4 μmol ·L-1正向和反向引物，1 μL模板DNA，200 nmol ·L-1 dNTP和1×FastPfu Buffer. 以不含DNA的PCR水来稀释. PCR反应程序设定为：94℃预变性2 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环，最终72℃延伸5 min. 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测. 扩增产物以AxyPrepTM凝胶回收试剂盒回收(AXYGEN公司).
1.3.3 扩增产物检测、 焦磷酸测序
扩增产物DNA浓度用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒测定(Invitrogen公司)，DNA样品以30 μL TE缓冲液稀释，在微细胞比色皿加入等量2X PicoGreen工作溶液，总反应体积60 μL. 以465~485 nm为激发波长，515~575 nm为发射波长，采用Turner Biosystems TBS-380荧光光度计测定其荧光强度. 浓度定量测定后，纯化后的DNA，等摩尔比例加入到试管中. 焦磷酸测序采用454 GS FLX Titanium测序方法(罗氏)，由上海美吉生物医药科技有限公司进行. 在0.03水平进行OTU聚类和物种分类分析. 以MOTHUR软件以及序列聚类软件Usearch4.0.38进行序列比较及分析. 所比对的数据库为Silva106 版.
2 结果与讨论
2.1 DO对A/O反应器去除有机物和氮磷的影响
A/O反应器启动成功后稳定运行近半年的时间. A、 B两组反应器内的A段和O的污泥浓度(MLSS)分别保持在3~4 g ·L-1和5~6 g ·L-1，MLVSS/MLSS的比值在71%~75%，污泥活性均较高. 图 2和图 3分别为进、 出水COD和氨氮浓度及其去除率随时间的变化. 两个HRT下，A、 B两组反应器出水的水质指标列于表 2. 可以看出，尽管进水的COD浓度波动较大，但COD的去除率保持稳定，A/O反应器具有良好的抗冲击性. 出水的BOD5均低于5 mg ·L-1，说明A/O反应器对有机物的生物降解比较彻底. HRT为20 h时出水COD的去除效果优于30 h. 在HRT为20 h时，A组反应器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B组反应器出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分别为67.0%和68.8%，TOC的去除率分别为64.4%和69.1%. 说明低DO浓度下运行对有机物的去除没有显著影响.
表 2 A、 B反应器出水指标分析
图 2 进、 出水COD浓度及其去除率随时间变化
图 3 进、 出水氨氮浓度及其去除率随时间变化
反应器运行初期，低DO运行的A组反应器出水的氨氮浓度较高，说明硝化菌的活性降低. 但经过3个月的运行后，两组反应器出水的氨氮浓度已经没有显著差别，氨氮的去除率均在90%以上.
2.2 反应器各段有机物和氮磷去除效率分析
A、 B反应器各段COD、 NH+4-N、 TN和TP的浓度变化如图 4所示. A、 B反应器的降解趋势基本一致. 考虑到100%硝化液回流到A段，COD和氨氮在A段大约被稀释了一倍. COD和氨氮的降解主要发生在O段. 有机物在O段基本完成降解，二沉池污泥絮凝沉降过程中，也会吸附一部分有机物，使COD浓度进一步降低.
氨氮在O段发生硝化作用转化为硝态氮，硝态氮在A段发生反硝化作用转变为氮气，因此TN的去除主要发生在A段. O段也有一定的去除作用，说明在O段也有一定数量的反硝化菌. A组反应器TN的去除率(31%)略高于B组(26%)，B组反应器O段的高溶解氧回流会影响A段的反硝化效果，从而影响TN的去除. 反应器出水的TN以硝态氮为主，亚硝态氮一直保持在非常低的水平(小于0.07 mg ·L-1)，表明硝化反应进行得较为完全. 出水硝态氮的增加主要来自氨氮和有机氮的转化.
对于TN，左侧柱状图为反应器A，右侧为反应器B
图 4 A、 B反应器沿程COD、 NH4-N、 TN和TP浓度变化
A/O反应器对于总磷的去除通过厌氧释磷、 好氧吸磷最终排泥而去除. B组反应器TP的去除率略高于A组，分别为39%和34%，说明聚磷菌的活性均较强. 出水总磷浓度低于1.0 mg ·L-1，达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准.
2.3 A/O反应器进、 出水溶解性有机物质组成分析
SMP是由于基质代谢(通常与生长相关)和污泥衰减释放的一类有机化合物，对于生化处理污水的出水水质和处理效率有重要影响，其主要成分为腐殖酸，多糖和蛋白质[13]. 进水中SMP所占COD的质量分数为30%左右，出水SMP对COD的贡献增至70%~75%. 进水及A、 B反应器出水SMP各组分的浓度变化如图 5所示. 多糖和蛋白质的降解主要依靠微生物自身的代谢，而腐殖酸几乎不能被微生物利用，只能依靠排泥去除. 蛋白质最容易被微生物利用，其次是多糖，去除率分别为61.3%和48.9%，腐殖酸的去除率只有16.5%. A、 B反应器对蛋白质和腐殖酸的去除效率基本相同，低DO运行的A反应器对多糖的降解效率比B反应器高20%左右.
图 5 进、 出水SMP各组分的变化
对反应器进出水进行3D-EEM扫描，结果表明进水中主要有3个峰，分别对应为酪氨酸类物质、 色氨酸类物质和SMP类物质[14]. 经过A/O反应器处理后，色氨酸类物质的峰基本消失，水中主要为酪氨酸和SMP物质，峰的强度较进水均显著减小，表明这些物质已被生物降解. A反应器出水峰的强度略高于B反应器出水.
2.4 不同DO条件下反应器O段污泥微生物种群结构解析
表 3为A、 B反应器O段污泥样品的454测序结果. 其中丰富度指数Ace和Chao1是估计群落中含有OUT数目的指数，生态学中常用来估计物种总数. 多样性指数Shannon和Simpson用来估计群落中OUT多样性高低的群落多样性指数. Shannon 值越大，Simpson越小，说明群落多样性越高. 从表 3数据可以看出，高DO运行的反应器B具有较高的菌群丰度和多样性，表明较高的DO浓度有利于好氧菌的生长和繁殖.
表 3 细菌种群多样性指数特征 1)
在门的水平，两个反应器O段污泥细菌种群分布如图 6所示. 主要优势菌群依次为变形菌门 (Proteobacteria)、 浮霉菌门 (Planctomycetes)、 拟杆菌门 (Bacteroidetes)、 绿弯菌门 (Chloroflexi)、 酸杆菌门 (Acidobacteria)、 放线菌门(Actinobacterium)、 蓝藻门(Cyanobacteria)、 绿菌门(Chlorobi)、 厚壁菌门(Firmicutes)、 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae). 变形菌门、 浮霉菌门和拟杆菌门菌群所占比重较大，在A、 B反应器中的比例分别为58.7%和59.2%、 14.7%和12.7%以及10.8%和12.4%，总和加起来接近85%. A、 B两个反应器比较，低DO运行的A反应器浮霉菌门、 厚壁菌门和芽单胞菌门细菌比例高于B反应器; 高DO运行的B反应器中拟杆菌门、 放线菌门、 绿菌门和硝化螺旋菌门细菌所占的比例高于A反应器. 污泥中的优势菌群变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多好氧、 厌氧或兼性细菌，具有多种代谢种类，也有一些无机化能种类(如可以氧化氨氮的亚硝化单胞菌属Nitrosomonas)，能够在降解有机物的同时完成脱氮除磷功能. 浮霉菌门是一小门水生细菌，在海水和淡水中都可被发现. 拟杆菌门菌群常在除磷系统中被报道，可降解蛋白质、 糖类等物质[15, 16].
仅列出大于0.5%的数据
图 6 在门的水平上，A、 B反应器污泥细菌菌群的相对丰度
在属的水平鉴定出的主要优势菌及其丰度如表 4所示. 可以看出，较高的DO有利于硝化作用，反应器中B中氨氧化菌Nitrosomonas和亚硝酸氧化菌Nitrospira的比例较高. 一些专性好氧菌如Planctomyces的丰度高. 一些厌氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax[17]以及聚糖菌Defluviicoccus在A反应器中的含量较高. 值得一提的是，有报道指出，鉴定出的Novosphingobium属、 Comamonas属、 Sphingobium属和Altererythrobacter属细菌具有降解多种多环芳烃、 氯代硝基苯、 农药和石油化合物的功能[18, 19, 20]，有利于石化废水的降解.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
表 4 在属的水平鉴定出的主要优势菌及其丰度
3 结论
(1)尽管石化废水的进水COD浓度波动较大，但A/O反应器出水COD的去除率保持稳定. 在HRT为20 h时，A组反应器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B组出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分别为67.0%和68.8%; 出水氨氮的平均浓度和去除率均为0.8 mg ·L-1和95%. 这表明DO在2~6 mg ·L-1范围内，DO浓度对有机物和氨氮的降解没有显著影响. 系统保持在低DO(2~3 mg ·L-1)运行可以大大减少曝气费用.
(2)A、 B反应器TN和TP的去除率分别为30%和26%，34%和39%. 进水主要为酪氨酸类、 色氨酸类和SMP类物质，A/O反应器出水主要为酪氨酸和SMP类物质，峰的强度较进水均显著减小.
(3)对O段污泥进行454高通量测序结果表明：优势菌群为变形菌门、 浮霉菌门和拟杆菌门菌群. 高DO运行的反应器B具有较高的菌群丰度和多样性，氨氧化菌Nitrosomonas和亚硝酸氧化菌Nitrospira的比例较高. 一些厌氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax在A反应器中的丰度较高. 两个反应器均检测出具有降解多种多环芳烃、 氯代硝基苯、 农药和石油化合物功能的Novosphingobium属、 Comamonas属、 Sphingobium属和Altererythrobacter属细菌.(来源及作者：清华大学核能与新能源技术研究院 丁鹏元、初里冰 中国地质大学(北京)水资源与环境学院 张楠湖南大学环境科学与工程学院 王星 清华大学核能与新能源技术研究院 王建龙)