潜流湿地是一种人工构建的高效污水净化湿地，它利用物理、 化学、 生物三重协同作用处理污水，具有显著的环境、 生态和经济效益[1, 2]. 目前，已广泛应用于生活污水、 垃圾渗滤液、 养殖废水等处理[3, 4]. 湿地中的植物根系可以深入到表层以下0.6-0.7 m的基质层中，并与基质形成透水的交织网络，拦截和吸附分解污水中的COD和氮磷等物质[5]. 有研究表明，在潜流湿地处理污水系统中，污水中70%的氮通过微生物作用去除[6]，其中厌氧氨氧化菌在湿地氮循环中有重要的作用，潜流湿地系统中ANAMMOX菌群对污水中氮的去除率占到总去除率的24%[7]. 相关研究认为，ANAMMOX广泛存在于海洋、 河口、 海湾、 河流、 湖泊、 陆地和淡水湿地等生态系统之中[8]，ANAMMOX对区域海洋沉积物微生物氮循环的贡献率为1.0%-67.0%[9, 10]，对河口和海湾沉积物微生物氮循环的贡献率为1.0%-42.0%[11]，对河流和湖泊微生物氮循环的贡献率最高可达40.0%-50.0%[12]. 另外，Long等[13]实验表明ANAMMOX在土壤氮循环中的贡献率达32.1%-77.9%. Zhu等[14]研究发现白洋淀湿地中ANAMMOX对微生物氮循环的贡献率为2.4%-35.0%. 以上研究充分说明ANAMMOX在自然生态系统中的重要作用，但由于自然状态下ANAMMOX菌生长缓慢，难以检测，关于ANAMMOX菌的研究进展缓慢. 近年来，随着16S rRNA分析和荧光原位杂交等技术的不断发展，以16S rRNA、 hzo、 nirS、 hzs和细胞色素C等基因克隆文库研究ANAMMOX菌的方法已经成熟[15]，ANAMMOX研究进入新阶段. 水产养殖污水含有较高的氮磷等富营养化物质，对养殖环境的污染较大，采用人工湿地净化养殖污水是近年新兴起的技术，但由于相关研究较少，目前对人工湿地的净化养殖污水的机理还了解不足，尤其是缺少针对湿地中ANAMMOX的研究. 为了解处理水产养殖排放污水潜流湿地中的厌氧氨氧化特征，本研究采用16S rRNA基因克隆文库、 实时荧光定量PCR和多样性分析等方法，探讨了潜流湿地中ANAMMOX菌的菌群结构、 多样性、 丰度特征，分析了提高潜流湿地的反硝化作用的方法，旨在为优化潜流湿地结构，提高潜流湿地净化养殖污水效率提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 潜流湿地
选择中国水产科学研究院池塘生态工程研究中心(上海泖港，N30°57′1.89″，E121°08′52.21″)用于处理养殖排放水的潜流湿地作为研究对象. 该潜流湿地面积1 500 m2(宽40 m，长37.5 m)，基质采用3级碎石配级，基质厚度70 cm，底部铺设0.5 mm HDPE 塑胶布做防渗处理. 潜流湿地的进、 出水区为长1.5 m、 粒径50～80 mm的碎石过滤区，中间净化区为长34.5 m的3层基质结构，其中底层基质厚度为30 cm、 粒径50～80 mm的碎石层，中间基质为厚度30 cm、 粒径20～50 mm的碎石层，上层基质为厚度10 cm、 粒径10～20 mm碎石层，湿地的水力坡度0.5%～2%，孔隙率0.30～1.0. 湿地表面种植有美人蕉、 鸢尾、 菖蒲等植物，种植密度为每平方米4株. 潜流湿地结构如图 1所示.
图 1 湿地剖面示意
该潜流湿地于每年3月到11月的养殖期间运行，运行基本参数为：水体停留时间0.5～4 d，表面负荷率BOD 80～120 kg ·(hm2 ·d)-1.
1.2 样品采集与处理
实验于2014年3月1日开始至11月15日结束. 分别于春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)在湿地进出水口的上、 中、 下层取基质样.
采样位置及数量：在潜流湿地的进水口(Wi)2-3 m处、 出水口(Wo)2-3 m处，上层(0-5 cm)、 中层(20-25 cm)、 下层(40-45 cm)采集基质样，每次采集基质样6个.
采样及保存方法：基质样采用人工挖掘到一定深度抽取泥水混合样，取样后立即装入无菌塑封袋，排除空气，密封，所有样品用冰盒保存送至实验室冷冻保存.
实验室样品处理：基质样品分析测定前需进行预处理，处理方法为在500 mL无菌塑料广口瓶中加入200 mL无菌水，放入半瓶基质样品，使用180 r ·min-1摇床振荡30 min，去除基质，然后将泥水混合物经3 000 r ·min-1离心10 min或经0.22 μm滤膜过滤后(泥土较少时)收集土壤，用于DNA提取.
1.3 DNA提取与PCR扩增
使用FastDNA SPIN Kit for Soil(美国Mpbio公司)试剂盒提取基质样品(收集的土壤)中的DNA. DNA质量经1%琼脂糖凝胶电泳检测，共得到18个样，分装成2份，一份用于菌群结构、 多样性的分析，一份用于定量分析.
将每个同批样的6个DNA样等量混合，采用巢式PCR对样品中的ANAMMOX菌16S rRNA基因进行扩增. 第一轮采用引物对Pla46f-630r，第二轮采用引物对Amx368f-Amx820r，反应条件参照文献[16]. PCR反应体系为Premix Ex Taq 12.5 μL; Forward primer 1 μL; Reverse primer 1 μL; 模板1 μL; ddH2O 9.5 μL.
1.4 文库构建和测序
对巢式PCR扩增样进行琼脂糖凝胶电泳，然后采用特异片段切胶，经GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)试剂盒纯化后，用pEASY-T1 Cloning Kit(全式金)试剂盒连接，然后转入Trans1-T1感受态细胞. 导入目的基因的感受态细胞经无氨苄LB培养基培养1 h后，涂布于含氨苄和蓝白斑检测试剂的固体LB平板上，经过夜培养后，每组样品挑取20个单克隆. 采用菌落PCR进行阳性克隆检测，选出18个阳性克隆接种于1 mL氨苄LB液体培养基中，在37℃摇床培养10 h，送上海Invitrogen公司测序.
1.5 菌落结构，多样性分析
所得序列经DNAStar软件编辑，去除载体序列后，采用Mothur软件划分操作分类单元(OTU). 选出每个OTU代表序列，用NCBI-BLAST工具比对，搜索相似序列并下载. 使用MEGA 5.05将相似序列与代表序列进行多重序列对齐，然后用邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树. 用Mothur软件计算菌落香农指数、 辛普森指数、物种丰富度和覆盖率，对菌落多样性进行分析.
1.6 实时荧光定量PCR与数据分析
分别用ANAMMOX菌16S rRNA的特异性引物AMX-808-F和AMX-1040-R对18个样品中ANAMMOX菌的16S rRNA基因拷贝数进行定量，用细菌16S rRNA通用引物1055F-1392R对总微生物16S rRNA基因拷贝数进行定量. 采用的PCR仪器为 iCycler iQ5 (Bio-Rad，California，USA)，PCR 反应条件参照文献[16].
2 结果与分析
2.1 潜流湿地中ANAMMOX菌群结构
对春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)(图表中分别用取样月份Mar、 Jun、 Sep表示)样品进行测序，共得到69条有效序列. 经Mothur 3%差异度划分OTU，共得到6个OTU. 其中，Mar、 Jun、 Sep样的OTU个数分别为3、 3、 4，表明潜流湿地中的ANAMMOX菌在不同季节中的OTU个数差异不大. 在所有OTU中，有2种OTU一直存在于潜流湿地中，为潜流湿地中ANAMMOX菌的优势种. 其它OTU随着时间变化而出现或消失，在Mar和Jun样中分别发现一个该时期特有的OTU，在Sep样中发现了2个该时期特有OTU，以上OTU与已知ANAMMOX菌16S rRNA基因比对显示亲缘关系较远，可能是具有ANAMMOX作用的新菌种(图 2).
图 2 不同季节潜流湿地ANAMMOX菌群结构
采取系统发育分析方法对潜流湿地中获得的ANAMMOX菌16S rRNA基因进行比对分析(图 3). 发现潜流湿地中包含Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia两类ANAMMOX菌. OTU 1#和OTU 2#与Candidatus brocadia fulgida的16S rRNA序列相似度分别高达98.2%-99.8%和97%-98.2%，属于Candidatus brocadia属，是潜流湿地中ANAMMOX菌的优势种. 其中，OTU 1#与河北沙河中发现的ANAMMOX菌序列相似度达到98.4%-100%，OTU 2#与水稻田中发现的ANAMMOX菌序列相似度为97.7%-100%[17]. 在图 3中，OTU 4#只存在于夏季Jun样中，与Candidatus kuenenia的16S rRNA序列相似度高达98.4%-98.9%，属于Candidatus kuenenia属，与杭州西溪湿地的ANAMMOX菌序列相似度高达98.9%-99.8%，应该是该时期特有种类.
图 3中，OTU 3#、 OTU 5#、 OTU 6#与目前已知的ANAMMOX菌16S rRNA序列相似度小于97%，为未知菌种. OTU 5#和OTU 6#为秋季Sep特有的两个种类，与已知ANAMMOX菌的亲缘关系较远，其中OTU 5#与Candidatus kuenenia stuttgartiensis的16S rRNA序列相似度仅为93.4%-93.6%. OTU 6#虽与Candidatus brocadia caroliniensis的16S rRNA序列相似度为93.1%-93.4%，但与钱塘江发现的ANAMMOX菌基因序列相似度高达97.5%-98.4%. OTU 3#为春季Mar特有，与Candidatus anammoximicrobium的16S rRNA序列相似度仅为76.4%，但与菖蒲根际土壤中发现的一些基因序列的相似度高达99.5%.
图 3 潜流湿地中ANAMMOX菌群序列与相似序列系统发育树
2.2 潜流湿地ANAMMOX菌的多样性
采用Mothur方法对潜流湿地中ANAMMOX菌的多样性进行分析. 结果发现，潜流湿地中ANAMMOX菌16S rRNA基因的克隆覆盖率超过95%(表 1)，表明本克隆文库结果能较好地代表潜流湿地ANAMMOX菌的菌群多样性水平. 从表 1中看出，不同季节ANAMMOX菌的香农多样性指数(H′)在秋季Sep最高(H′，1.21)，春季Mar最低(H′,0.64)，说明随着养殖时间延长和水体富营养化程度增大，潜流湿地中的ANAMMOX菌多样性水平越来越高.
表 1 潜流湿地中ANAMMOX菌的多样性水平
2.3 潜流湿地中ANAMMOX菌的丰度
使用定量PCR法对不同季节的18个样品进行分析. 结果表明，不同季节的样品中均有ANAMMOX菌存在，其丰度(以鲜重计，下同)范围在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之间，且多数样品的丰度超过106 copies ·g-1. 在不同季节中，潜流湿地ANAMMOX菌的丰度差异较大，其中春季Mar出水口的下层最低，夏季Jun出水口的下层最大，二者差异超过102倍(图 4).
Wi为进水口，Wo为出水口,下同 图 4 不同季节不同层面厌氧氨氧化菌丰度对比
对不同季节潜流湿地不同层面中ANAMMOX菌的丰度分析发现，在潜流湿地的水平方向，春季Mar进水口的上、 中、 下层中ANAMMOX菌的丰度均高于出水口的上、 中、 下层. 夏季Jun出水口的上、 中、 下层中ANAMMOX菌的丰度均高于进水口的上、 中、 下. 秋季Sep则表现为进水口上层和下层中的ANAMMOX菌丰度低于出水口的上层和下层，进水口中层ANAMMOX菌的丰度显著高于出水口中层(图 4).
在潜流湿地的垂直方向，春季Mar和秋季Sep均呈现为湿地中间层ANAMMOX菌的丰度高于上、 下层，但夏季Jun的ANAMMOX菌丰度却表现为下层>中层>上层(图 5).
图 5 不同季节厌氧氨氧化菌丰度垂直分布
以上结果表明，潜流湿地中ANAMMOX菌的丰度存在明显的空间差异，包括水平分布和垂直分布差异，但这种差异没有随时间变化的规律性(图 4和图 5).
2.4 潜流湿地中总细菌的丰度
对不同季节潜流湿地不同层面中的总细菌丰度进行了测定. 结果显示，潜流湿地中总细菌的丰度在7.3×109-9.1×1010 copies ·g-1之间，最小值出现在春季Mar出水口的上层，最大值出现在夏季Jun出水口上层(图 6). 分析显示，不同季节潜流湿地不同层面中的总细菌丰度在时空上差异不明显，潜流湿地中ANAMMOX菌占总细菌的比率范围在0.74×10-5%-10.8×10-5%之间.
图 6 不同季节不同层面总细菌丰度对比
3 讨论
本研究通过巢式PCR技术在处理养殖排放水的潜流湿地中检测出了2种已知和3类未知ANAMMOX菌. 其中Candidatus brocadia属在潜流湿地中分布最广，为处理养殖排放水潜流湿地中ANAMMOX菌的优势种，与大多数淡水水域ANAMMOX菌优势种一致[14, 18, 19]. 另据其他研究邻近水域厌氧氨氧化的报道，在长江口、 西湖底质中检测出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus scalindua 这3类ANAMMOX菌[11, 20]，在太湖底质中检测出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus jettenia 这3类ANAMMOX菌[21]. 本实验在潜流湿地中共检测出Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia 这2类已知ANAMMOX菌，虽然与附近水域相比种属较少，但与白洋淀湿地和东江河完全一致[14, 22]. 在养殖期间的3个季节，潜流湿地中Candidatus brocadia属一直都存在，说明是潜流湿地ANAMMOX菌的优势种. 本实验发现Candidatus kuenenia属只出现在夏季，可能与该期间养殖水环境中的某些因子剧烈变化相关. 多数研究认为，盐度是影响Scalindua属分布的重要因子，但也有研究表明影响ANAMMOX菌种群的因素有很多，氮素、 碳氮比、 温度等因素对ANAMMOX菌种群分布都有影响. 由于养殖排放水中的污染物以碳氮磷为主，关于碳氮磷等的比例、 组成等对ANAMMOX的影响作用研究还需进一步深入.
本研究发现处理养殖排放水的潜流湿地中ANAMMOX菌的香农多样性指数在不同季节依次表现为秋季(Sep)>夏季(Jun)>春季(Mar)，说明潜流湿地中ANAMMOX菌的多样性随着养殖时间延长和养殖饲料投入增加而增高. 王谨[23]研究发现，秋季典型淡水养殖池塘中厌氧氨氧化细菌的多样性比夏季更高，认为秋季是水产养殖饲料等投入最大的时期，也是水产养殖环境变化的高峰期，为适应外部环境，ANAMMOX菌可能表现出了更高的多样性.
本研究发现处理养殖排放水潜流湿地ANAMMOX菌的丰度范围在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之间，与淡水湿地生态系统中监测到的ANAMMOX菌丰度相当[24, 25, 26, 27]. 另外，Zhu等[16]在研究水稻土壤中ANAMMOX菌丰度垂直分布特征时发现，土壤深度为40-50 cm处的ANAMMOX菌丰度最高，与本研究发现的夏季(Jun)潜流湿地ANAMMOX菌的垂直分布特征一致. 不同的是处理养殖废水潜流湿地表层(0-5 cm)的ANAMMOX菌丰度要低于中层(20-25 cm)，这与Zhu的研究结果相反，可能与潜流湿地相对较为疏松的基质结构有关. 总体看，夏季(Jun)潜流湿地中ANAMMOX菌的丰度高于秋季(Sep)，但秋季(Sep) ANAMMOX菌的多样性却高于夏季(Jun). 前面分析认为ANAMMOX菌多样性增高是适应外部环境的结果，虽然夏季(Jun)不是饲料等营养物投入的高峰期，但进入夏季后大量投入的富营养物可能会引起ANAMMOX菌的大量生长.
反硝化是潜流湿地的重要功能. 目前，在处理水产养殖污水的潜流湿地设计中一般只关注湿地的硝化反应和植物作用等，对湿地的反硝化作用重视不足. 鉴于ANAMMOX在湿地氮循环中具有重要的作用，提高湿地反硝化效果可以极大地提高湿地的净化效率. 本研究发现不同季节潜流湿地ANAMMOX菌的多样性和丰度差异巨大，这种现象除与养殖排放水的污染浓度不同外，可能还与湿地的结构以及布水方式有关，为了提高湿地的污水净化效率，在夏秋季节适当缩短潜流湿地的水力停留时间或将传统推流布水方式改为垂直流进水有可能会提高湿地的反硝化效果，另外采用多波段的湿地结构可能也是提高反硝化的重要方法. 总之，随着对湿地反硝化研究的深入，将会为处理养殖排放水提供更高效的人工湿地技术.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
4 结论
(1)处理水产养殖污水的潜流湿地中存在Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia两类厌氧氨氧化菌和3类未知的ANAMMOX.
(2)处理水产养殖污水的潜流湿地中ANAMMOX菌的多样性在不同季节存在差异，且多样性随着养殖时间延长而逐步增大.
(3)处理养殖排放水的潜流湿地中ANAMMOX菌的丰度在水平分布和垂直分布上存在明显差异，但无季节变化规律.（来源及作者：上海海洋大学水产与生命学院 曾宪磊 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 刘兴国 吴宗凡 时旭 陆诗敏）