苯胺类化学品广泛用于染料、 农药、 橡胶以及油漆的制造中[1, 2, 3]，此类化学品易随着工业废水、 农业径流水、 生活污水排放到环境中，对水生生物和人体健康产生潜在危害[4, 5].
化学品在环境中的去除途径主要有挥发、 水解、 吸附[6, 7]和生物降解. 由于苯胺类化学品亨利常数较低，且不含有易于水解的官能团，挥发和水解并非其在污水处理厂中的主要去除过程[8]，而主要是以生化作用去除含苯胺类化学品的废水[9, 10]. 在以生化方法为主要工艺的污水处理厂中，pH、 温度、 微生物活性、 活性污泥浓度以及水力停留时间等条件对化学品的去除过程影响较大[11]. 因此研究苯胺类化学品在污水处理厂中的归趋过程，对于评估其环境暴露，环境风险防控具有重要意义.
生物降解性测试目前普遍采用经济合作与发展组织提出的化学品生物降解性测试导则，包括快速生物降解性301、 固有生物降解性302和模拟生物降解性303A[12]，利用这种层层递进的方式来评估其在环境中的归趋过程. 模拟生物降解303A与快速生物降解性测试(301系列)的不同之处在于测试过程中活性污泥的浓度高低以及活性污泥是否经过驯化等; 模拟生物降解303A是更高水平的测试，更接近于实际情况，比快速生物降解性301、 固有生物降解性302的结果更真实和可靠[13]，能为评估化学品在污水处理厂的去除和归趋提供有效的实验数据[14].
4-硝基苯胺以及氯代苯胺是一类典型的苯胺取代物，可以通过皮肤以及眼睛渗透进动物体，具有潜在的致癌以及诱发基因突变[15, 16]的严重影响，近年来许多国家将此类物质列为优先污染物[17, 18]，4-异丙基苯胺主要来源于除草剂异丙隆的合成和代谢[19]，但是关于它们的环境风险影响现在文献中鲜有报道，因此，本文在303A方法的基础上着重研究了不同水力停留时间条件下4-硝基苯胺、 4-异丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的生物降解性，探讨了这3种化学品的生物降解动力学及降解影响因素，以期为此类化学品的环境暴露评估以及废水处理提供基础数据.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
好氧生化污水处理模拟系统见图 1; 液质联用仪(; TOC分析仪(3100，耶拿，德国); 分析天平(MS105DU，梅特勒，瑞士); 高速冷冻离心机; 水质多参数测定仪(HQ 40d，哈希，美国); 纯水器.
A. 贮存罐; B.进水泵; C.曝气罐(4.5 L); D.沉降池(2.3 L); E.回流泵; F.收集罐图 1 好氧生化污水处理模拟系统
4-硝基苯胺(CAS:100-01-6，分析纯); 4-异丙基苯胺(CAS：99-88-7，分析纯); 2-氯-4-硝基苯胺(CAS:121-87-9，分析纯)均购自百灵威化学. 甲醇(色谱纯，Merck KGaA).
实验中的活性污泥采自南京某生活污水处理厂的曝气池.
1.2 好氧生化污水处理模拟实验方法
生化污水处理模拟系统(如图 1)放置于室温(25℃±0.2℃)避光环境中，将活性污泥悬浮液(3 g ·L-1)接种于曝气罐中，开启电源及曝气泵，连续充氧. 并加入适量合成污水(牛肉浸膏11 g ·L-1，蛋白胨16 g ·L-1，尿素3g ·L-1，NaCl 0.7 g ·L-1，CaCl2 ·H2O 0.4g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.2 g ·L-1，磷酸氢二钾 2.8 g ·L-1)[20]作为提供活性污泥生长的能源.
实验期间不断向贮存罐中加入含苯胺类化学品和合成污水，保持进水苯胺类化学品的浓度为1 mg ·L-1且溶解性有机碳浓度为100 mg ·L-1. 开启进水提升泵和污泥回流泵，初始实验溶液以420 mL ·h-1的流速进入曝气罐中，平均水力停留时间(HRT)约为11.2 h，污泥停留时间为8 d. 当化学品去除率达到稳定后，调整进水泵转速改变水力停留时间(6、 12和24 h)继续测试. 实验期间，每天测定曝气罐中活性污泥悬浮固体的浓度，并定期去除回流的剩余污泥，使污泥浓度稳定在3 g ·L-1.
实验期间，定期取进水及出水各10 mL，过0.45 μm滤膜，加200 μL 0.1 mol ·L-1盐酸酸化去除水样中无机碳后，用TOC分析仪测定DOC，每个样品3个平行. 使用水质多参数测定仪测定曝气罐中pH、 溶解氧(DO). 从曝气罐中收集100 mL污泥，高速离心机(10 000 r ·min-1)离心5 min后弃去上清液，将下层污泥团称重后置于105℃中烘干、 称重，差值法计算混合液中的悬浮固体含量.
LC-MS/MS方法：取进水、 出水以及回流污泥样品，加入等体积的甲醇超声25 min后过0.22 μm滤膜后，采用电喷雾离子源、 负电离模式、 多反应离子监测扫描定量分析目标物. 气帘气压350 000 Pa，喷雾气压379 214 Pa，辅助加热气压413 688 Pa，源温度450℃，离子化电压5 500 V. 选择ZORBAX Eclipse Plus C18 Column (150 mm×2.1 mm，3.5 μm，Agilent，USA)分离样品. 流动相2 mmol ·L-1甲酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，以0.5 mL ·min-1流速进行梯度洗脱，进样量5 μL，梯度洗脱条件见表 1.
表 1 梯度洗脱程序
1.3 生物降解动力学实验方法
模拟实验结束时，此时活性污泥已对苯胺类化学品完全适应，从曝气罐中取200 mL活性污泥悬浮液，使用高速冷冻离心机(5 000 r ·min-1)离心5min后弃去上清液，然后用去离子水重新溶解污泥团，充分混匀分散后重复上述步骤至少3次，从而尽可能地完全洗涤污泥中的污染物，最后用去离子水将洁净的污泥配制成3 g ·L-1的悬浮液. 向其中添加3种苯胺类化学品，浓度为1 mg ·L-1，持续搅拌培养，确保溶解氧达到2 mg ·L-1以上，在36 h内定时取样并测定污泥悬浮液中的化学品浓度.
1.4 数据处理与计算
采用Office Excel表格计算与处理数据，涉及的主要计算如下.
1.4.1 DOC去除率计算
式中,Dt为系统中t时刻DOC去除率(%); ci为进水DOC质量浓度(mg ·L-1); ce为出水时的DOC质量浓度(mg ·L-1).
1.4.2 化学品去除率计算
式中,R为化学品去除率(%); STi 为进水化学品质量浓度(mg ·L-1); STe为出水时化学品质量浓度(mg ·L-1).
1.4.3 化学品去除动力学计算
d=d0e-kt (3) 式中,d为t时刻化学品的残留百分比(%); d0为化学品初始的残留百分比(%); k为反应速率(h-1); t为时间(h).
式中,DT50为化学品浓度减少一半的时间(h); k为反应速率(h-1).
所得数据采用Origin8绘图软件作图.
2 结果与讨论 2.1 生化污水处理模拟系统运行情况
活性污泥中含有大量微生物，微生物活性对化学品生物降解性结果影响显著. 模拟系统中DOC去除率，是反映微生物活性以及系统是否运转正常的重要指标，不同HRT(6、 12、 24 h)对系统DOC去除的结果见图 2. HRT为6、 12和24 h时，系统DOC平均去除率从70.2%依次增加至80.3%、 88.3%. HRT较短时，化学品与微生物接触时间较短，还未充分生物利用就被排出系统，增加HRT可以促进化学品的降解; 但是实际污水处理厂中，需根据进水量、 进水水质、 处理能力、 运行成本等多方面因素综合设定合适的HRT.
图 2 不同水力停留时间下的DOC去除率
污水处理厂曝气池pH是影响生物降解性的重要影响因素，pH过高不利于污泥生长，还会破坏新生的污泥[21]; pH值过低时菌胶团生长受到抑制，而真菌生长占据优势，污泥絮体将遭到破坏和污泥膨胀等[22]. 通常在好氧生化反应池中，能降解硝基苯类化合物的优势菌属最适的pH为6.5~8.5[3, 23]，由图 3可见，本模拟实验曝气罐中pH维持在6~8，适宜开展苯胺类化学品的生物降解研究.
在好氧生化反应池中，溶解氧是反映一个好氧系统生物活性能力的重要参数，溶解氧浓度要达到2 mg ·L-1以上时，才能为好氧菌群提供充足的氧. 如图 3所示，实验期间，氧化罐中溶解氧初始值为4.4 mg ·L-1，随着系统稳定运行后逐步稳定在8.5 mg ·L-1，由于本模拟系统较小，通过连续曝气，溶氧浓度较易控制.
图 3 实验过程中溶解氧和pH变化
2.2 HRT对苯胺类化学品去除率的影响
在好氧生化污水处理模拟系统中，HRT是影响化学品去除率的重要因素，它是可以人为调控的关键参数. HRT过大会使有机质过度增长从而对微生物产生聚集和毒性影响，HRT过短会导致细菌分散冲蚀[24]，因此有必要通过实验研究获取合适的水力停留时间，从而维持系统的稳定运行以及准确的化学品去除率.
实验期间，通过调节水力停留时间(12、 24、 6 h)，分析进、 出水苯胺类化学品的去除率. 结果显示见图 4，初始HRT设置为12 h时，3种化学品12~15 d去除率非常低，其中2-氯-4-硝基苯胺和4-硝基苯胺去除率基本为0，4-异丙基苯胺去除率约为15%. 实验开始21 d后，3种物质开始有了明显的去除，其中2-氯-4-硝基苯胺去除率不稳定，在0和15%之间波动; 4-硝基苯胺去除率从28%上升至88%，平均去除率约为64.7%; 4-异丙基苯胺去除率从30%上升至98%，平均去除率约为76%. 这3种化学品出现较长的降解停滞期(12~15 d)，在此期间，微生物可能需适应此类化学品，同时也可能是降解优势菌种的生长对数期.
实验开始34 d后，将HRT由12 h调节为24 h，4-硝基苯胺去除率增加并维持在69%~89.4%; 4-异丙基苯胺去除率上升至79%~99%，它们的平均去除率分别为75%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺去除率仍然很低，去除率约为11%.
实验开始62 d后，将HRT由24 h调节为6 h，4-硝基苯胺去除率降低至55%，此后去除率在35%~56%范围波动，平均去除率为48%. 4-异丙基苯胺去除率降至59%，此后去除率在48%~75%范围波动，平均去除率为66%. 2-氯-4-硝基苯胺在HRT为6 h时，去除率低于15%.
分析可知，当微生物适应3种苯胺类化学品后，HRT为12h和24 h时，4-硝基苯胺和4-异丙基苯胺的平均去除率均可达到80%; HRT为6 h时，4-硝基苯胺和4-异丙基苯胺去除率显著降低，且去除率稳定性降低; 2-氯-4-硝基苯胺则在所有条件下都未观察到明显的去除. 本研究表明在好氧污水处理系统中，HRT为24 h时可以有效且稳定去除苯胺类化学品.
图 4 苯胺类化学品在不同水力停留时间的降解速率曲线
亨利常数(H)可用于表征化学品在水气界面之间的分配过程，根据Whiteman双阻力理论，当化学品H=2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1时，化学品从水相迁移至气相时，水相的阻力为气相阻力的十分之一，挥发速率可以忽略[25]. 4-硝基苯胺、 4-异丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺H分别为0.035、 0.5和9.67×10-4 Pa ·(m3 ·mol)-1，它们的H远小于2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1[26]，因此在曝气过程中的挥发性损失可以忽略. 当化学品吸附系数(lgkoc)大于3.3时，化学品可能会显著地吸附于污泥中并随剩余污泥排出系统[27]，4-硝基苯胺、 4-异丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺的lgkoc分别为1.64、 2.53、 2.25，不具有显著吸附性. 此外，有文献提到自然界中的硝基类芳香化合物以及2-氯-4硝基苯胺只有通过人工催化发生光氧化反应，并且自发的光降解反应对污染物去除的贡献值极低[28, 29]，好氧生化污水处理系统位于较暗的室内环境，因此由光照引起的化学品轻微的降解可以忽略. 综上，可以初步确定本研究中3种化学品在系统中的去除主要源自于生物降解.
2.3 苯胺类化学品的生物降解动力学
模拟生物降解性303A实验方法只能得到化学品的去除率结果，无法得到化学品生物降解速率和降解动力学信息，而该信息在化学品风险评估中可用于评估环境暴露水平. 本研究使用模拟实验中已经完全驯化和适应的活性污泥测定过的3种苯胺类化学品的生物降解动力学参数. 由图 5降解曲线可知，4-硝基苯胺和4-异丙基苯胺易降解，36 h后生物降解率分别为80%和98%; 2-氯-4-硝基苯胺生物降解速率极低，36 h后生物降解率为20%.
图 5 3种化学品的降解动力学曲线
化学品降解通常遵循一级动力学方程，表 2列出了按照一级动力学方程拟合的3种化学品的动力学去除方程、 降解速率常数以及半衰期. 3种化学品一级动力学曲线拟合相关性均在0.95以上. 4-异丙基苯胺、 4-硝基苯胺和2氯-4-硝基苯胺在好氧生化活性污泥中的降解半衰期分别为6.01、 16.16和123.75 h. 有研究表明，在好氧条件下适当浓度的硝基芳香化合物可以发生降解[30]，Khalid等[31]通过混合培养不动杆菌等3种微生物去除染料废水中4-硝基苯胺，发现初始浓度为100 μmol ·L-1的4-硝基苯胺在72 h内可完全去除，杨彬等[32]研究也表明4-硝基苯胺在好氧条件下具有较高的降解速率，与本研究结果一致.
表 2 3种化学品动力学方程、 降解速率与半衰期
OECD 303A实验模拟了真实的生物质与受试物浓度[33]，能客观评估苯胺类化学品在污水处理阶段的归趋，通常3 g ·L-1的活性污泥浓度是好氧降解条件下微生物的最高浓度，而在地表水等其他环境中微生物浓度远远低于此浓度. 有研究认为化学品生物降解速率正比于微生物的细胞数量[34]，因此也可据此将本研究中化学品在好氧活性污泥中的降解速率外推获得在地表水等环境中的生物降解速率.
2.4 苯胺类化学品取代基对生物降解性的影响
有机化合物的结构决定了其在环境中的生物降解性. 苯胺是易于生物降解的化学品，本研究中3种取代苯胺所含的官能团有—NO2、 —Cl和异丙基，它们的生物降解速率从高到低依次为，4-异丙基苯胺>4-硝基苯胺>2-氯-4-硝基苯胺. 通过定量结构与生物降解性关系[35]研究发现，异丙基对化学品生物降解起着积极的作用[36]，而—NO2、 —Cl等基团吸电子能力强，会降低微生物中酶的活性，阻碍化学品的生物降解性[37]. 因此，4-硝基苯胺的生物降解速率比4-异丙基苯胺小. 2-氯-4-硝基苯胺未发现明显的生物降解也是因为苯环上同时引入氯原子及硝基2个吸电子基团后，苯环电子云密度减小，导致微生物及相关酶的亲电攻击性减弱，此外由于碳-氯键的牢固性，使得此类物质难以降解[6]. 化学品自身组成对它们生物降解性的影响有待进一步研究.
此外，—NO2、 —Cl等基团对微生物还有一定的毒性作用，本研究中添加的实验浓度较低(1 mg ·L-1)，避免了较高浓度下对微生物产生的毒性抑制作用，因此本研究中得到的苯胺类化学品的生物降解结果更能反映它们在真实环境条件下的情形.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
3 结论
(1)提高HRT可促进DOC以及苯胺类化学品的去除. HRT为6、 12和24 h时，系统DOC去除率依次为70.2%、 80.3%和88.3%; 4-硝基苯胺去除率分别为48%、 64.7%和75%; 4-异丙基苯胺的去除率分别为66%、 76%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺在不同HRT条件下，较难去除，去除率平均值低于20%.
(2)4-硝基苯胺、 4-异丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的降解符合一级动力学方程，回归系数皆大于0.95，生物降解半衰期分别为6.01、 16.16和123.75 h.
(3)苯胺类化学品取代基对好氧生物降解性影响显著，异丙基对降解有积极作用，硝基和氯原子等基团抑制生物降解.（来源及作者：南京工业大学化学与分子工程学院 古文 徐炎华 陈国松 环境保护部南京环境科学研究所 刘济宁 陈国松 周林军 石利利）