贡湖表层水域抗生素研究

2017-05-08 13:43:20 2

   抗生素(antibiotics)是主要由细菌、霉菌或其它微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物,它能在较低浓度下有选择性地作用于菌体细胞特定环节,干扰细胞的代谢作用,妨碍生命活动或使停止生长,甚至死亡.中国是抗生素使用大国,也是抗生素生产大国,据国家卫生部医院管理研究所药事管理研究部对抗生素滥用公共安全问题研究提供的资料,我国每年抗生素原料生产量约为21万t,18万t在国内销售,人用、牲兽用各一半,人均消费量138 g,是美国人均使用量的10倍以上(美国仅13 g).据WHO资料显示,我国抗生素使用率中,门诊感冒患者75%、外科手术高达95%、住院患者80%,其中使用广谱抗生素和联合应用的患者占58%,远高于国际上规定的抗生素使用率不超过30%的标准.因此,相比欧美国家,中国的抗生素滥用现象尤为凸显,且日益严重.

  进入人和其它动物体内的抗生素大多不能被充分吸收利用,随排泄物进入废水或直接排入环境.相关研究表明现阶段的水处理技术对污水中含有的相当一部分抗生素没有明显的去除效果,虽然抗生素的半衰期很短,但是由于频繁的使用和排入,导致抗生素在水体中形成持续存在的状态,影响水环境系统,进而对人类健康及整个生态造成长期的潜在危害.有报道指出:由于受某药厂排放抗生素污水的影响,南京自来水中甚至检测出了阿莫西林,水体中抗生素的污染风险引起了广泛的关注.但目前,我国对水体中抗生素的研究主要集中在河流、河口、海湾、水库等水体,如广西邕江、大辽河、珠江口、钦州湾、深圳铁岗、西丽水库;此外还有渤海湾、莱州湾、白洋淀、维多利亚港和珠江、黄浦江等水环境中.太湖贡湖湾是无锡和苏州两城市重要的水源地,其周边经济发达,人口密度大,因此其水质安全对于无锡和苏州的发展极为重要.有研究表明贡湖周围分布有大量人口,且存在禽畜养殖和较大面积水产养殖,因此抗生素使用量较大,这些抗生素如若处理不当进入水体,会给贡湖生态安全带来极大风险.但目前关于贡湖水中抗生素污染的研究还较少,为此本文以贡湖表层水为研究对象,分析其中抗生素的组成及分布特征,并初步评价其生态风险,以期为贡湖的污染防治及环境保护提供科学的参考依据.

  1 材料与方法

       1.1 采样点设置

  贡湖是位于太湖东北部的一个湖湾,西北临无锡市,西南与太湖相通,面积147 km2,平均水深2 m,是无锡和苏州两个城市重要的水源地[19],为了全面了解贡湖水域的抗生素污染情况及其风险程度,共布设9个采样点,其中包括贡湖主要河流长广溪、小溪港、望虞河、金墅港、石帆港等河口.并根据苏锡二市贡湖水域的划分、采样点分布区域的特点将其分为南北两区,采样点位置及分布图见表 1、图 1.

 

图 1 贡湖湾采样点分布示意

 

   表 1 贡湖湾采样点位置分布表

  1.2 试剂与仪器

  所用主要设备有: Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL, 美国Waters公司);配有三重四级杆检测器的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS, Agilent 1200-6410A, 美国);ZORB-AXC18色谱柱(4.6 mm×150 mm×5.0 μm)混合纤维素脂微孔滤膜(0.22 μm,0.45 μm);氮吹仪;固相萃取装置.

  所用主要药品: Milli-Q实验用水(Millipore, Bedford, MA, 美国);硫酸;甲酸、乙腈、甲醇(HPLC级, J.T.Baker公司,美国);乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA, 分析纯).

  抗生素目标物:四环素(tetracycline, TC)、金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)购自中国药品生物制品检定所;氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、诺氟沙星(norfloxacin, NOR)、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)、磺胺醋酰(n-sulfanilylacetamide, SAAM)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxypyridazine, SMP)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine, SMD)、磺胺甲基异唑(sulfamethoxazole, SMX)、磺胺喹啉(sulfaquinoxaline, SQX)、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim, TMP)、磺胺间二甲基嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、罗红霉素(roxithromycin, ROX)标样购自德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司.内标指示物:仪器内标13 C3-咖啡因(13 C3-caffeine, I. S.),购自美国剑桥同位素实验室;回收率指示物: 13 C6-磺胺甲噻二唑(13 C6-sulfamethizole, S. S.),购自Toronto Research Chemicals Inc.(North York,ON,加拿大).上述标准物均为固体纯品,纯度>95%.

  1.3 样品采集及预处理

  样品采集:采样日期为2013年8月上旬,时间为上午09:00,采用GPS定位仪定位.水样均采集表层水,样品采集后置于棕色玻璃瓶中,加入3 mol ·L-1的硫酸溶液调节pH=3,避光低温保存尽快运输至实验室,并存放至4℃冰箱以待测定.抗生素由国家环境分析检测中心检测.

  样品预处理:取水样500 mL,然后调节pH=3.0,并使用0.45 μm的混合纤维素脂微孔滤膜滤除水中悬浮颗粒物,加入回收指示剂13 C-磺胺甲噻二唑50.0 μL (标准样品质量浓度为1.0 mg ·L-1)和金属离子耦合剂Na2EDTA 0.4 g,使样品混合均匀待测.并使用活化后的HLB小柱进行富集.待样品富集完成后,依次使用4 mL高纯水和4 mL 10%的甲醇进行清洗,然后在氮气保护下干燥30~45 min除去残留水分,再使用8 mL甲醇对HLB小柱淋洗,将富集的物质洗脱下来,收集洗脱液于10 mL试管中,并在40℃水浴条件下氮吹浓缩至近干后用10%甲醇溶液将样品定容至1.0 mL,加入内标指示剂13 C3-咖啡因(CAF),将定容后的溶液通过0.22 μm纤维滤膜过滤后,使用液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行检测.

  1.4 HPLC-MS/MS仪器分析条件

  色谱条件:所使用色谱柱为ZARBAX Eclipse plus C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm).流动相A为乙腈,B为0.1%的甲酸溶液,流速设定为300 μL ·min-1,进样量为10 μL, 柱温为30℃.实验操作中具体的梯度淋洗程序参数见表 2.每个梯度洗脱操作完成后还原流动相位初始状态,并稳定3 min.

  

    表 2 梯度洗脱程序分离参数

  质谱条件:采用多反应监测(MRM)模式进行检测.离子源为电喷雾离子源(ESI),在正离子模式下扫描,雾化器压力为40 psi,毛细管电压为4000 eV,干燥器流速稳定为8 L ·min-1.

  质量控制:采用内标法对样品进行定量分析,在优化条件下进行测定,使用抗生素标准溶液的质量浓度为1.0~500 μg ·L-1范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2均不低于0.99(P < 0.05).准确量取500 mL水,按照实验方法加入25 ng混合标准品,测定6次,由6个样品测定的标准偏差计算检出限和最低定量浓度.当加标水平为0.05 μg ·L-1时,6次实验的RSD (相对标准偏差)为2.70%~12.90%,各目标物的回收率为71%~105%,说明该方法重现性较好[21].检出限为0.003~0.016 μg ·L-1,最低定量浓度为0.011~0.054 μg ·L-1 .

  1.5 生态风险评估方法

  根据欧盟的技术指导文件(TGD)中关于环境风险评价的方法,药品在环境中的生态风险可以根据风险商值(RQs)大小来评估. RQs的计算可以通过污染物的环境预测浓度(predicted environmental concentration, PEC)或者实际监测浓度(measured environmental concentration, MEC)与预测无效应浓度(predicted no-effect cocentration, PNEC)的比值获得:

 
 

  式中,PEC:环境预测浓度,ng ·L-1;MEC:环境实测浓度,ng ·L-1;PNEC:预测无效应浓度,ng ·L-1;LC50:半致死浓度,ng ·L-1;EC50:半最大效应浓度,ng ·L-1,LC50与EC50均由查文献所得;AF:评价因子;RQs:综合毒性熵值.

  环境生态风险的高低根据Hernando等[25]提出的RQs分类方法来评估生态风险等级: RQs < 0.1为最低风险;0.1≤RQs < 1为中等风险;RQs≥1为高风险.

  2 结果与讨论

       2.1 贡湖湾水体中抗生素的浓度分布

  贡湖湾水体中监测的16种抗生素,分4大类:四环素类(TC、OTC、CTC)、喹诺酮类(NOR、OFL、CIP、ENR)、磺胺类(SAAM、SMR、SMP、SMD、SMX、SQX、SDM、TMP)、大环内酯类(ROX).在检测分析的16种抗生素中,除了磺胺醋酰(SAAM)、磺胺二甲基嘧啶(SMD)和磺胺间二甲基嘧啶(SDM)外,其余13种都有不同程度的检出.各采样点抗生素检出质量浓度见图 2、图 3.采样点2总抗生素检出残留量最高,达6.504 μg ·L-1.

  

(a)、(b)、(c)、(d)分别表示四环素类、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类抗生素在各采样点的质量浓度以及所占该点的总抗生素浓度的百分含量

图 2 贡湖湾四类抗生素在各采样点的质量浓度分布及其百分含量

  

图 3 贡湖湾各采样点抗生素质量浓度与种类分布

  土霉素(OTC)、氧氟沙星(OFL)、磺胺甲基异唑(SMX)在采样点2检出量最高,分别为4.72、0.474和0.007 μg ·L-1.环丙沙星(CIP)和甲氧苄氨嘧啶(TMP)在采样点4检出量最高分别为0.269 μg ·L-1和0.208 μg ·L-1.四环素(TC)、诺氟沙星(NOR)和罗红霉素(ROX)在采样点5检出量最高,分别为1.85、0.271和0.023 μg ·L-1.恩诺沙星(ENR)、磺胺甲基嘧啶(SMR)在采样点6检出量最高,分别为0.229 μg ·L-1和0.017 μg ·L-1.金霉素(CTC)和磺胺喹啉(SDM)在采样点7检出量最高,分别为1.03 μg ·L-1和0.005 μg ·L-1.磺胺甲氧哒嗪(SMP)在采样点8检出量最高,为0.478 μg ·L-1.

  从图 2可以看出,四环素类抗生素北区明显高于南区,且2号点最高,其中土霉素(OTC)在北区1~4号点质量浓度远高于北区的5号以及南区其余四点.北区1~5号点以及南区6~8三点四环素类抗生素占该点的总抗生素质量浓度的50%以上.喹诺酮类主要分布在北区2~4号和南区6、7、9号采样点,且占9号采样点总质量浓度的50%以上.磺胺类在南区6~8点普遍偏高,其中磺胺甲氧哒嗪(SMP)含量最高,这是一种在中国使用较多的畜用抗生素之一,在南区较高的原因可能与南区的大面积的水产养殖有关.此外大环内酯类罗红霉素各点差异不大,且都不是各点抗生素的主要组成.

  综上,各抗生素的总检出水平为:土霉素(OTC)>四环素(TC)>金霉素(CTC)>磺胺甲氧哒嗪(SMP)>氧氟沙星(OFL)>诺氟沙星(NOR)>甲氧苄氨嘧啶(TMP)>恩诺沙星(ENR)>环丙沙星(CIP)>罗红霉素(ROX)>磺胺甲基嘧啶(SMR)>磺胺甲基异唑(SMX)>磺胺喹啉(SQX).按照抗生素种类,四类抗生素的检出水平为:四环素类(n.d~4.72 μg ·L-1)>磺胺类(n.d~0.478 μg ·L-1)>喹诺酮类(0.014~0.474 μg ·L-1)>大环内酯(0.014~0.023 μg ·L-1).参照表 3可知,与我国其它地表水环境中主要抗生素质量浓度相比贡湖湾水域抗生素质量浓度处于一般水平,其中四环素类处于较高水平,而磺胺类、磺胺类、大环内酯相比处于稍低水平.

 

   表 3 国内不同水体中抗生素质量浓度比较

  2.2 贡湖湾抗生素的污染特征

  根据贡湖周边环境和行政区划,贡湖分为南、北两区(图 1和表 1).所有监测的抗生素数据如表 4所示.

  

   表 4 贡湖湾水体南北区抗生素质量浓度及检出率

  在检出的13种抗生素中,喹诺酮类(NOR、OFL、CIP、ENR)和磺胺类中的甲氧苄氨嘧啶(TMP)以及大环内酯类的罗红霉素(ROX)的检出率为100%;其次为四环素类的土霉素(OTC),检出率高达89%;四环素(TC)和磺胺甲氧哒嗪(SMP)检出率为78%;金霉素(CTC)检出率为68%;其余3种检出率都不足50%.

  根据区域划分,贡湖湾北区(1~5号采样点)的5个采样点中,监测的16种抗生素中共检测出11种,其中四环素类3种,喹诺酮类4种,磺胺类有3种,大环内酯类1种;而在南区(6~9号采样点)的4个采样点中检出12种抗生素,其中四环素类3种,喹诺酮类4种,磺胺类4种,大环内酯类1种.除此以外,南北两区域检出各种抗生素浓度的平均值也各有不同.

  综合表 4和图 4可以看出来,在监测的点位上抗生素的平均值在南北两个湖湾互有高低,各不相同.其中四环素类的检出量明显北部高于南部,特别是土霉素(OTC)尤为突出;而磺胺类和喹诺酮类抗生素的平均值南部相比北部相对要高一些,这说明南部湾这两类抗生素的污染要更重一些;大环内酯类抗生素的平均值在两个湖湾内含量相当.

  

图 4 贡湖湾南北湖湾抗生素质量浓度

  由于贡湖的抗生素主要来源于周边的水产养殖、禽畜养殖使用的抗生素对贡湖的输入及贡湖流域居民药用抗生素残留的输入.因此,出现这样的现象的主要原因是南北两湖湾的周围的环境不同.曹卉等在2011年的研究中划定了环贡湖范围离岸3 km内的148 km2区域,区域内共有13.71万人,其中在北部湾的无锡境内有7.21万人,占全部的54.6%,其中城镇和乡村人口分别占36%和67%;而苏州境内的6.5万人中乡村人口占到97%,城镇人口仅为3%.除此之外,在贡湖研究区域3 km以外地区无锡境内城镇化程度也相对高于该地区苏州境内的城镇化程度.而四环素类作为抗菌谱广,价格便宜的抗生素药,在城镇化程度高的地方使用量远多于乡村,因此可能造成四环素类在北部湾比南部湾高一些.相比之下,南部湾苏州地区的5万人中,有97%的为乡村人口,养殖牲畜较多,且贡湖区域内有鱼塘6320 km2,全部位于南部湾苏州境内的通安镇和东渚镇,主要分布在渚镇河、游湖及田鸡港河道两侧,农用、畜牧养殖业或动物疾病治疗药物的抗生素使用量相对较高.喹诺酮类作为人畜共用抗生素在我国被广泛应用,且被认为是理想的抗菌药物,在我国普遍且大量用于禽畜养殖;磺胺类抗生素由于其抗菌谱广、疗效强等特点在我国已广泛应用于如畜牧养殖和水产养殖等的养殖业.南部湖湾地区由于村镇较多相比禽畜养殖较多,同时贡湖水域的全部水产养殖都位于南部湖湾的苏州地区,这可能是造成这两类抗生素在南部湖湾较高的原因.

  2.3 贡湖湾抗生素生态风险评价

  本研究中,PNEC值是通过阅读文献收集抗生素对一些物种的急性和慢性毒理数据求出的[20, 28~33].基于最坏情况考虑,PNEC计算筛选使用最敏感物种获得,同时环境中实测抗生素浓度选择最大值计算.计算结果见表 5.

  

   表 5 抗生素对应最敏感物种毒理数据

  根据RQs风险熵值的计算评价方法,计算得贡湖湾检测出的13种抗生素RQs值如表 6.从中可看出处于高风险抗生素有5种,占检出种类38.5%,分别为四环素类OTC以及喹诺酮类NOR、OFL、CIP和ENR,说明贡湖湾中四环素类中OTC以及喹诺酮类4种抗生素对贡湖中相应敏感水生生物存在慢性或急性毒性风险;处于中风险有4种,占检出种类的30.8%,分别为TC、CTC、ROX和SMX;其余4种抗生素处于低风险,占检出种类的30.8%,分别为SMR、SMP、SQX和TMP,其生态风险并不显著.

 

    表 6 贡湖湾水域抗生素风险商值

  评价结果显示,处于中高风险的9种抗生素中包括监测四环素类全部4种、喹诺酮类全部4种和大环内酯类全部1种以及磺胺类1种,环丙沙星(CIP)尤为突出.四环素类和喹诺酮类及大环内酯类罗红霉素主要用于医药或农用养殖用药,具有相对较高的RQs风险,且这几类抗生素在贡湖检出质量浓度相对较高,这说明此类抗生素药物在贡湖周围居民中使用量较大,使用频率高.残留水中的抗生素可能会对水生生物产生一定的急性或慢性毒性效应,同时抗生素的长期残留还可能会刺激病原菌产生耐药性,这势必会对原有稳定的生态系统产生影响;其次,养殖用抗生素的大量使用可能会导致禽畜鱼类产生耐药性,长期食用具有耐药性的肉和蛋对人类健康可能具有潜在威胁.同时,医用的四环素类和大环内酯类罗红霉素以及人用的喹诺酮类的滥用可能会使病菌产生抗药性,进入体内未被完全代谢的抗生素会在人体内富集,威胁人体健康;此外,抗生素的频繁过量使用容易引发毒副作用,从而影响人体健康.

  综上所述,当前贡湖水域抗生素风险问题不容忽视,应该引起注意并加以防范,避免滥用现象,从而降低相应生态风险.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。

  3 结论

  (1)贡湖湾水体监测的16种抗生素,除磺胺醋酰(SAAM)磺胺二甲基嘧啶(SMD)和磺胺间二甲基嘧啶(SDM)外,共检出13种抗生素,质量浓度范围0.005~4.720 μg ·L-1. 13种抗生素中,OTC (土霉素)检出浓度最高,4.720 μg ·L-1;SQX (磺胺喹啉)检出浓度最低,仅为0.005 μg ·L-1,且仅在7号采样点有检出.四类抗生素检出水平为:四环素类(n.d~4.72 μg ·L-1)>磺胺类(n.d~0.478 μg ·L-1)>喹诺酮类(0.014~0.474 μg ·L-1)>大环内酯(0.014~0.023 μg ·L-1).对比国内其他水体环境,贡湖湾水体抗生素质量浓度总体上处于一般水平,但局部采样点(如2号点)和个别抗生素(如土霉素、喹诺酮类)检出浓度较高,应该引起足够的注意.

  (2)贡湖水体中检出的13种抗生素中,喹诺酮类(NOR、OFL、CIP、ENR)和磺胺类中的甲氧苄氨嘧啶(TMP)以及大环内酯类的罗红霉素(ROX)的检出率为100%,其余检出率也是相对较高的,这说明在贡湖湾周围抗生素使用量大.同时,检出抗生素在南北两湖湾的检出水平互有高低,其中四环素类抗生素北部湾要高于南部湾,而喹诺酮类和磺胺类抗生素南部湾的检出量要高与北部湾,这是由于南北湖湾周边不同的社会生活环境造成的.

  (3)通过风险商值法评价检出的13种抗生素,结果表明贡湖湾水域中检出的抗生素中,处于高风险的(即RQs>1)抗生素有5种(OTC、NOR、OFL、CIP、ENR),占检出种类38.5%,其中环丙沙星(CIP)尤为突出;中风险(0.1 < RQs < 1)有4种(TC、CTC、ROX、SMX),占检出种类30.8%;其余4种(SMR、SMP、SQX、TMP)为低风险(RQs < 0.1).整体来看,贡湖水域抗生素存在一定生态风险,尤其是四环素类和喹诺酮类风险程度较高,应引起足够的注意,并采取相应防范措施.

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