城市污水从用水设施排出时，自身是不含或者仅含有极少量的硝化菌. 但是，城市排水管道内表面、 管底沉积物和污水中存在了大量高活性的微生物. 城市污水从排放口，经过排水管道、 明渠等下水管网长达数小时甚至十几小时的输送，到达污水处理厂时，往往会由于管渠壁上生物膜的脱落等原因可能会含有一定量的硝化菌. 这也是在城市污水处理厂的启动时，采用传统的自然培养方法或利用初沉污泥以进行快速自然培养可以达到良好的硝化效果的原因. Brion等运用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术对加拿大魁北克省蒙特利尔市附近的3个污水厂的进水及活性污泥中硝化菌群落结构进行调查分析，发现活性污泥中的硝化菌多样性低于进水中硝化菌多样性，而且78%的AOB和86%的NOB一致. Saunders等对Denmark的3个污水厂的进水与活性污泥进行微生物群落多样性测序分析发现，活性污泥中有35%OTUs(62% reads)存在于进水中. 但是Lee等利用16S rRNA基因序列分析法对韩国首尔的4个污水厂的进水与活性污泥中微生物进行鉴定，发现二者仅有4.3%~9.3%的OTUs一致，从而认为原水中微生物对活性污泥系统的影响较小. 常用的活性污泥模型ASM1、 ASM2和ASM3都假定进水中的硝化菌(自养菌XA)含量也是设定为0 mg·L-1，并假定相对过程中生成的微生物量，进水中微生物质量浓度可以忽略. 而目前许多有关硝化菌的研究集中在生化系统内，对于城市污水自身带入系统的硝化菌很少涉及，而要了解这部分硝化菌对污水处理厂活性污泥系统的影响，就需要明确以下3个问题: ①城市污水中是否含有活性污泥中硝化菌的优势菌属? ②这部分硝化菌是否具有硝化活性?③如果城市污水与活性污泥中硝化菌一致，而且具有硝化活性，那么这部分硝化菌对活性污泥系统将有着连续自然接种的作用，而城市污水处理厂进水带入的这部分硝化菌对活性污泥系统的连续接种强度有多少?
本研究利用荧光原位杂交技术等方法对西安市两个已运行多年的大型污水处理厂(西安市第二、 第三污水处理厂)进水中的硝化菌群落结构与硝化性能进行初步调查分析，并通过硝化活性估算进水中硝化菌对活性污泥系统的连续接种强度，以期为活性污泥模型的优化及城市污水处理系统的设计与运行提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 实验样品
西安市第二污水处理厂(二污)、 西安市第三污水处理厂(三污)样品取自曝气沉砂池出水，取样间隔为一至两周，连续调查4个月.
西安市第二污水处理厂主要服务南二环路以南到南三环路之间和曲江池以西的区域，服务面积为53.5 km2，自运行以来，污水厂一期自运行以来的日处理能力为10×104～13×104 m3·d-1; 西安市第三污水处理厂主要服务纺织城地区，一期日污水处理能力约10×104m3·d-1，其中工业污水、 生活污水量大约各占一半，服务面积为25.09 km2. 两个污水厂进水为典型的城市污水.
1.2 荧光原位杂交
样品用1×PBS缓冲溶液洗涤3次，然后用4%的多聚甲醛固定2 h，再用1×PBS缓冲溶液洗涤3次. 实验中采用的探针序列及杂交条件见表 1，其中氨氧化细菌采用CY3标记，亚硝酸盐氧化细菌采用CY5标记，Comp Ntspa662、 Comp NIT3无荧光标记，EUB采用FITC标记. 按照杂交缓冲液中甲酰胺浓度由低到高的顺序进行杂交.
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表 1 荧光原位杂交所用的探针及对应杂交条件 |
样品杂交后用封片剂封片，并在共聚焦显微镜(Leica TCS SP8 X,Leica Microsystems,Mannheim,Germany)下观察. 每个样品随机取10~20个视野，最终结果采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8软件分析.
实验中以NSO1225探针杂交的细菌数量表示氨氧化细菌(AOB)总数量，亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的总数是以Ntspa662、 NIT3、 Ntcoc206和Ntspn693所杂交的细菌数量的总和表示，总细菌数量是以EUBmix所杂交的细菌数量表示，AOB和NOB数量各占真细菌比例计算参照张岩等的方法.
1.3 硝化速率测定
5~10 L水样离心(12 000 r·min-1，Z36HK离心机，Beckman Coulter Inc.,USA)浓缩，离心后的污泥再稀释至1 000 mL，将温度控制在20℃，pH控制在7.5. 曝气3~4 h，以去除污泥中少量未淘洗干净的有机物. 测定氨氧化速率时，加入叠氮化钠(浓度为24 μmol·L-1)以抑制NOB呼吸，测定亚硝酸盐氧化速率时，加入聚丙烯基硫脲(浓度为86 μmol·L-1)，前一至两小时测定内源呼吸速率(溶解氧仪，Seven2Go S9,Mettler Toledo)，内源呼吸速率(以N计)稳定后分别加入30mg·L-1的NH4Cl和NaNO2，测定氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率.
2 结果与讨论
2.1 城市污水中硝化菌群落结构
图 1为城市污水样品的荧光原位杂交照片(绿色为CY3 标记的AOBmix，红色为Cy5标记的NOBmix，蓝色为FITC标记的EUBmix). 采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8软件对杂交照片进行统计分析，二污与三污进水中硝化菌占总细菌数的平均个数百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分别为(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，与硝化正常的二污与三污活性污泥中硝化菌百分含量接近[平均分别为(6.6±1.5)%和(8.4±3.1)%][16]. 这个结果证实了进入生物反应池的城市污水中存在大量的硝化菌.
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图 1 城市污水样品荧光原位杂交照片 |
由于城市污水的来源包括工业废水和生活污水，自身一般都不会含有硝化菌，所以这部分硝化菌很有可能是在城市污水管网输送过程中产生，虽然一般认为城市污水处于缺氧或者厌氧状态，但是由于城市污水管网非满流设计、 城市污水输送过程中存在跌水甚至明渠等原因，空气中的氧会不断传递至城市污水中，从而为硝化菌的繁殖创造一定的条件，但是城市污水中硝化菌的确切来源有待进一步调查分析. Brion等发现城市污水中硝化菌的含量与排水管网的服务面积正相关，服务面积越大，硝化菌浓度越高.
图 2和图 3分别为两个污水厂进水中AOB和NOB的硝化菌群落结构分布. 从中可以看出，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage为城市污水中氨氧化菌的优势菌，同时也检测到Nitrosospira的存在，与二污和三污活性污泥中氨氧化菌群落结构接近. 以往研究中对城市污水中的硝化菌优势菌属的检测尚未见到，一般都集中在污水处理系统内的活性污泥中，而对活性污泥的检测中，Limpiyakorn等发现在城市污水传统活性污泥法处理系统中，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage为氨氧化菌的优势菌; Siripong等对7个污水处理厂分别在冬季和夏季进行硝化菌群落结构调查，发现尽管污水厂在冬季和夏季的温度、 污泥龄不同，但是其中氨氧化菌的优势菌均为Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage，冬季Nitrosospira份额略有增加. Wang等和曾薇等对多个污水处理系统中的氨氧化菌群落结构进行分析，也发现氨氧化菌优势菌均为Nitrosomonas. 在硝化运行正常的北石桥和第三污水处理厂的进水中氨氧化优势菌与以上诸多研究中的活性污泥的氨氧化优势菌一致，均为Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage. 这个结果也可根据K/r繁殖策略解释，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage属于r-strategists，Nitrosospira属于K-strategists，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage (r-strategists)在高氨氮浓度条件下更具竞争优势. 而调查期间二污与三污城市污水中氨氮平均浓度分别为 38.5mg·L-1和39.9 mg·L-1，因此在城市污水中Nitrosomonas europea(r-strategists)与Nitrosospira(K-strategists)相比，更具竞争优势.
| 图 2 城市污水中AOB的种群结构 |
| 图 3 城市污水中NOB的种群结构 |
由图 3可以看出，进水中NOB的优势菌均为Nitrospira，次优势菌为Nitrobacter，且与Nitrococcus、 Nitrospina并存，与二污和三污活性污泥中亚硝酸盐氧化菌群落结构接近. Jauffur等运用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术对加拿大魁北克省蒙特利尔市附近的3个污水厂的进水与活性污泥中的Nitrospira细菌进行分析，结果发现城市污水中平均有99个细菌分类操作单位(OTUs)，而活性污泥中仅有83个细菌分类操作单位(OTUs). 这些结果证实城市污水中存在大量的Nitrospira，而且其多样性高于活性污泥. 而污水厂活性污泥中Nitrospira与Nitrobacter并存，而且Nitrospira是活性污泥系统中NOB的优势菌属. 这说明常规活性污泥中亚硝酸盐氧化菌的优势菌属也大量存在于城市污水中. 这些结果同样可以利用K/r繁殖策略解释，Nitrobacter属于r-strategists，Nitrospira属于K-strategists，而一般城市污水中亚硝盐浓度低于常规检测方法的检测下限，活性污泥系统中亚硝酸盐浓度一般也低于1mg·L-1，因此在活性污泥系统中Nitrospira与Nitrobacter相比，更具竞争优势，而城市污水中由于亚硝酸盐浓度更低，Nitrospira的竞争优势更为明显.
2.2 城市污水中硝化菌活性
为考察城市污水处理厂进水中硝化菌的活性，实验采用呼吸法对检测两个污水处理厂进水中硝化菌的氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率进行测定.
图 4和图 5分别为进水中硝化菌在加入氨氮和曝气后，氨氧化速率、 亚硝酸盐氧化速率随时间的变化趋势，从中可以看出，与常规活性污泥硝化性能测定不同的是，原污水中硝化菌在曝气初期活性较低，氨氧化菌活性在曝气2~12 h后，亚硝酸氧化菌活性在曝气6~16 h后，活性基本恢复至最大值. 亚硝酸盐氧化菌活性恢复所需要的时间比氨氧化菌活性恢复所需要的时间长. 调查期间二污进水中平均最大氨氧化速率为(0.32±0.12) mg·(L·h)-1，平均最大亚硝酸盐氧化速率为(0.71±0.18) mg·(L·h)-1; 三污进水中平均最大氨氧化速率为(0.43±0.17) mg·(L·h)-1，平均最大亚硝酸盐氧化速率为(0.58±0.27) mg·(L·h)-1. 因此，可以判断出，城市污水中的氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌具有硝化活性，在建立活性污泥模型及污水厂设计时，应当考虑城市污水中硝化菌对活性污泥系统的影响，但也应当充分考虑进水中硝化菌所需要的适应时间.
| 图 4 OUR历时变化 |
| 图 5 OUR历时变化 |
2.3 城市污水中硝化菌对活性污泥系统的影响
调查结果表明，城市污水中含有活性硝化菌，这部分硝化菌将对活性污泥系统进行自然连续接种(natural continuous seeding). 为了衡量城市污水中硝化菌对活性污泥系统的影响，定义每天由城市污水带入的硝化菌数量与活性系统中原有硝化菌数量的比值为原污水中硝化菌对活性污泥的连续接种强度，可以根据公式(1)计算:
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式中，qseed为硝化菌连续接种强度，g·(g·d)-1; Qin为城市污水处理厂的日进水量，L·d-1; Xin,nitrifiers为城市污水中硝化菌浓度，mg·L-1; V为城市污水处理厂生物反应池的容积，L; Xnitrifiers为活性污泥中硝化菌浓度，mg·L-1.
表 2为调查期间二污与三污进水与活性污泥的硝化活性平均值，以及根据公式(1)所计算的添加强度.
| 表 2 二污、 三污进水及活性污泥的硝化性能及连续接种强度 |
由表 2可以看出，城市污水每天给活性污泥系统带入了大量的具有硝化活性的硝化菌，氨氧化菌连续接种强度在0.08~0.09 g·(g·d)-1，亚硝酸盐氧化菌连续接种强度在0.11~0.24 g·(g·d)-1. 低于Jauffur等所计算加拿大LaPraire污水处理厂0.3g·(g·d)-1的接种强度，该厂的进水流量为65 000 t·d-1，HRT为15 h，SRT为7 d，二级处理工艺采用传统活性污泥法. LaPraire污水处理厂的温度与污泥龄低于本研究所调查的污水处理厂，而接种强度会受进水中硝化菌浓度与活性污泥硝化菌浓度的影响，温度越低，污泥龄越短，活性污泥中硝化菌的含量就会大幅降低，而进水中硝化菌的接种效应就会越明显.
但这些结论与Lee等调查发现的进水与活性污泥中的微生物仅有4.3%~9.3%的OTUs一致，并得出进水中微生物对活性污泥系统的影响较小这一观点相矛盾. 引起这一矛盾的原因可能是因为: 硝化菌生长缓慢，活性污泥系统中硝化菌自身增殖的数量少，由城市污水带入的硝化菌对活性污泥系统的影响较大，因此二者硝化菌种群结构接近. 而异养菌则相反，它在活性污泥系统中增殖的数量远大于城市污水带入的异养菌数量，因此异养菌的种群结构更容易受活性污泥系统的设计与运行条件的影响. 由于活性污泥中硝化菌的份额较小，Lee等的调查结果主要是针对异养菌.
Larsen等在2008年的研究结果中表明硝化菌尤其是亚硝酸盐氧化菌比活性污泥中一般的细菌更容易形成密实和牢固的小菌落，从图 1城市污水样品的荧光原位杂交照片中也可以观察到这个现象. 根据这一特性，如果污水处理工艺中包含初沉池时，进水中的大部分硝化菌将进入初沉污泥. 因此，在活性污泥模型及污水处理厂的设计尤其是初沉池的设计中有必要考虑由城市污水自身带入的硝化菌对污水处理厂运行的影响.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3 结论
(1) 西安市第二、 第三污水处理厂进水中硝化菌占总细菌数的平均个数百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分别为(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，进水中氨氧化菌(AOB)优势菌为Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage; 亚硝酸盐氧化菌(NOB)的优势菌均为Nitrospira，次优势菌为Nitrobacter，且与Nitrococcus、 Nitrospina并存.
(2) 城市污水中硝化菌具有硝化活性，在曝气2~16 h后，活性基本恢复，最大氨氧化速率分别为(0.32±0.12) mg·(L·h)-1和(0.43±0.17)mg·(L·h)-1，亚硝酸盐氧化速率为(0.71±0.18)mg·(L·h)-1和(0.58±0.27) mg·(L·h)-1.
(3) 城市污水中含有活性硝化菌，对活性污泥系统有连续自然接种的作用，根据进水及活性污泥中硝化活性估算出城市污水中AOB和NOB对活性污泥的连续接种强度分别为0.08~0.09 g·(g·d)-1和0.11~0.24 g·(g·d)-1. 因此，在活性污泥模型建立及污水处理厂设计中有必要考虑由城市污水自身带入的硝化菌对污水处理厂运行的影响.