1 引言
目前，我国河流普遍受到污染.排放到水体中的污染物可通过沉积、沉淀等作用在底泥中积累，使得底泥成为一个微生物种类丰富、物质交换频繁的复杂环境.环境条件的改变亦能直接或间接地改变微生物的群落结构;而微生物亦能通过同化、异化作用对底泥中的污染物进行降解从而改变区域环境条件.细菌和古菌是微生物的重要组成部分，能参与到碳、氮、硫等元素的循环过程中，对促进底泥中污染物的分解、减少污染积累、维持良好水质具有重大的作用.目前，关于水环境中微生物群落结构及其环境因子耦合关系的研究已经成为热点，但多集中在湖泊与海洋等环境中，涉及江河的较少，特别是关于底泥中细菌与古菌群落结构对比的研究更是鲜见报道.
浑河作为辽河流域最重要的支流之一，是沿岸城市重要的地下水补给水源.以沈阳为例，其在浑河的取水量占全市取水总量的3/4;而位于上游抚顺市的大伙房水库，是辽宁省最大的人造蓄水水库，并作为沈阳、抚顺、盘锦等城市的重要饮用水源地.由于传统重工业的发展和人口数量的剧增，大量的工业废水和生活污水排放到浑河中，致使浑河流域尤其是下游水质遭受污染.目前，关于浑河的研究集中于氮、磷等污染物，以及重金属和藻类等.
因此，本文利用PCR-DGGE技术考察浑河表层底泥中细菌与古菌的多样性与群落结构情况，并通过相关性分析方法来研究微生物多样性与水环境因子间的关系，以期更为深入地掌握河流底泥微生物的分布特征，为河流生态系统的生物法修复提供科学依据.
2 材料与方法
2.1 研究区域与采样点的设置
浑河是辽河流域最重要的支流之一，河流全长约415 km，位于辽宁省东部(122°20′~125°20′E，41°00′~42°20′N)，发源于长白山支脉滚马岭西侧，流经清原、抚顺、沈阳、辽中、鞍山等市，并在海城市与太子河汇合后经大辽河由营口注入渤海湾.根据浑河的自然条件，本研究共设置了14个采样点，其中，干流共设置9个采样点，并分别在社河、章党河、抚西河、白塔堡河、细河5条主要支流汇入干流处设置采样点，具体分布见图 1.
图1 采样地点示意图(采样点：1: 南杂木；2: 社河入浑口；3: 章党大桥；4: 章党河入浑口；5: 抚西河入浑口；6: 葛布大桥；7: 高坎大桥；8: 白塔堡河入浑口；9: 黄腊坨；10: 细河入浑口；11: 于家房；12: 对坨；13: 三岔河大桥；14: 田庄台)
2.2 样品采集与分析
于2013年11月下旬，采集水样和底泥样品.水样采集：用不锈钢采水器采集水样，采集深度约在底泥上方2 cm处，水样保存在500 mL聚乙烯采样瓶中，放入带有冰块的保温箱，运回实验室储存于4 ℃冰箱内;底泥采集：用灭菌的柱状采泥器采集表层底泥(0~10 cm)，样品采集后置于无菌自封袋中，置于干冰上运回实验室，于-80 ℃冰箱中保存.
使用便携式水质测定仪(Thermo Orion Star，赛默飞世尔科技有限公司)现场测定水温、pH和溶解氧(DO).于实验室内，按照文献方法测定以下主要水质污染指标：五日生化需氧量(BOD5)、总磷(TP)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)和叶绿素(Chl-a).
2.3 DNA的提取和聚合酶链式反应(PCR)
使用 Power Soil DNA Kit(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA)对浑河底泥样品进行总DNA的提取，提取结果经1%的琼脂糖凝胶电泳检测.
采用巢式PCR对底泥样品中细菌和古菌的16S rRNA基因进行扩增，两轮扩增产物作为后续变性梯度凝胶电泳(DGGE)的上样样品.对于细菌，第一轮引物为27F和1492R，第二轮引物为357F和518R.第一轮反应条件为：95 ℃预变性2 min;95 ℃变性1 min，53 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，循环30次;最后72 ℃延伸10 min.第二轮反应除退火温度为55 ℃外，其它条件同第一轮反应.对于古菌，第一轮引物为PRA46F和PREA1100R，第二轮引物为PARCH 340F和PARCH 519R.第一轮反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性l min，65~55 ℃退火50 s，每个循环温度降低0.5 ℃，72 ℃延伸1.5 min，循环20次，然后在55 ℃的退火温度下继续扩增，循环15次;最后72 ℃延伸7 min.第二轮反应除退火温度先为63~53 ℃循环20次、后为53 ℃循环15次外，其它条件同第一轮反应.
以上扩增体系均为50 μL，包括：2×PCR GoTaqGreen Master Mix(Promega，USA)25 μL，上下引物各1 μL(10μmol · L-1)，DNA模版2μL(1~10 ng)，最后用ddH2O补足至50 μL.为保证基因片段的稳定迁移、提高DGGE的分辨效率，分别在上游引物357F和PARCH 340F的5′ 端添加一个长度为40 bp的GC夹.
2.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
使用美国Bio-Rad公司的D-Code电泳系统进行变性梯度凝胶电泳.DGGE上样样品分别为细菌和古菌第二轮带GC夹引物扩增的产物，每条泳道的上样量均为25 μL.聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%(丙烯酰胺 ∶ 甲叉丙烯酰胺=37.5 ∶ 1)，细菌与古菌变性剂浓度梯度范围分别为40%~60%和20%~50%.在1×TAE缓冲液中，恒定温度60 ℃、恒定电压70 V的条件下，电泳15 h.用SYBR gold(Invirogen，USA)核酸染料染色30 min后，拍照分析.
各采样点细菌和古菌的香浓-威尔多样性指数(Shannon-Wiener Index，H′)、种群丰度(Richness，R)及均匀度(Evenness Index，E)均通过Quantity One(Bio-Rad，USA)软件来计算电泳条带的迁移率灰度条带数量得到，具体为：
式中，pi指一种特定菌群相对总菌群的比率，pi=ni/N，ni为第i条条带的强度，N为所有条带强度之和，S为每条泳道DGGE条带的数目.
采用非加权成对算数平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean)对DGGE指纹图谱进行聚类分析，研究各采样点间的相似性.
2.5 数据统计与分析
将DGGE图谱条带的位置和亮度分别类比于物种的种类和数量，利用Canoco for windows 4.5软件分别对细菌和古菌的DGGE图谱条带的数字化结果进行DCA分析，得到样品矩阵第一轴的最大梯度长度均小于3，因此，选用冗余梯度分析方法(RDA)来分别计算环境因子与细菌、古菌群落组成变化的相关性.
3 结果与讨论
3.1 水样的理化指标
各采样点水质的理化指标见表 1.由表 1可知，浑河上覆水水质均呈弱碱性.各采样点水中溶解氧(DO)浓度变化范围不大，除沈阳段的两大支流白塔堡河与细河在浑河的汇入口外，其余采样点浓度均大于10 mg · L-1.叶绿素(Chl-a)浓度变化趋势较为明显，从上游到下游浓度明显增大，特别是在沈阳市下游地区，各个采样点的叶绿素(Chl-a)的浓度值均大于80 mg · L-1，最大值达180.93 mg · L-1.分析其原因可能是因为下游地区多为农村地带，来自农村生活污水和农业面源的氮、磷等营养物增多，导致藻类大量繁殖.
表1 水质理化指标
3.2 细菌与古菌的DGGE图谱分析
3.2.1 细菌群落结构分析
浑河底泥样品中细菌DGGE的指纹图谱如图 2所示.可以看出，上游底泥样品中条带数量要明显小于下游样品，说明上游底泥中细菌种类与下游相比较少;且上游样品中条带亮度较为平均，说明其优势菌种并不明显，而中、下游样品中的部分条带，如条带3、4、6、7、8、9和10的亮度相对于其它条带明显较大，说明这些条带所代表的细菌在下游采样点中相对于其它菌种数量较多.
图2 细菌的DGGE分析图谱
聚类分析结果如图 3所示，可知14个底泥样品中细菌群落大致可分为4个大簇.其中，章党大桥(3#)与其它样品的差异较为明显，这可能与其周边的啤酒厂有关.由于啤酒废水成分与其它排放到浑河的污水成分差异较大，久而久之，排放到该采样点水体中的污染物质不断沉积到底泥中，导致底泥中的细菌群落结构发生显著的变化;其它底泥样品的细菌群落在系统树上明显分成3个大簇，结合实际的地理位置分析，可分为3段：①乡村段：上游采样点南杂木(1#)与社河(2#)为一大簇，两者皆在大伙房水库上游，其间人口密度小，没有大型工厂等污染源，水中污染物浓度相对下游河段较低;②城市段：中游采样点章党河(4#)至高坎大桥(7#)为一大簇，其采样点分布在浑河的抚顺市至沈阳市段部分，受城市生活污水和工业废水影响较大;③城镇段：下游采样点白塔堡河(8#)至田庄台(14#)为一大簇，其间没有大城市，流经的地点多为小城镇或乡村，污染物主要源自于农村生活污水和农业面源.各个大簇内又可细分为更小的相似性族群，而空间上相邻的两采样点底泥的总细菌群落结构的相似性一般较高.
图3 细菌DGGE图谱聚类(UPGMA)分析
分析上述现象产生的原因可能是因为处于城市地区的河段，由于城市生产、生活废水的大量排放，超过了其自净能力，致使污染物沉积到底泥中，改变了原有系统的营养物循环.而环境条件的改变又导致底泥中一些土著细菌因不能适应环境的改变而遭到淘汰，而另一些能够适应新环境的细菌大量繁殖，破坏了底泥中原有的细菌群落结构平衡;相反，乡村地区河流由于受人为因素的干扰较小，底泥细菌群落也明显不同于城市河流段.
总体上，浑河底泥样品中的细菌群落结构出现了较为明显的分区特征，这与关于松花江底泥中细菌群落分布的研究结果明显不同.研究发现，松花江底泥中的细菌群落分布不存在明显的地域分区现象，部分不相邻的采样点反而具有较高的群落相似度.他认为之所以发生上述现象可能是由于松花江相邻两采样点之间并没有严格的分界线，细菌可以四处迁徙，因此，分区现象不明显.而浑河上、中、下游3段的采样点间水质逐渐变化，各段内水质情况较为类似，导致其底泥中细菌群落结构亦呈现逐渐演替的趋势，因此，分区现象明显.
底泥样品细菌的多样性指数、种群丰度及均匀度见表 2.从浑河上游至下游，细菌群落的多样性指数和种群丰度总体均呈现先逐渐上升再逐渐下降的趋势，且分别在白塔堡河处达到最大值3.88和4.54.说明从上游至下游，浑河底泥中细菌群落多样性先增加再降低，群落中优势微生物所占比重加大.
表2 底泥样品细菌与古菌的多样性指数、种群丰度及均匀度
3.2.2 古菌群落结构分析
浑河底泥样品中古菌的DGGE指纹图谱如图 4所示，可看出上游和下游底泥样品中古菌的条带数量要小于中游底泥样品的条带数，说明上游和下游底泥中古菌种类较中游少.总体来说，14个采样点中较亮的条带并不多，只有位于下游的采样点对坨(12#)存在6条相对较亮的条带，说明浑河底泥中古菌并不像细菌那样存在某些数量相对其它菌种较多的菌种，而是各菌种数量相差不大.
图4 古菌的DGGE分析图谱
聚类分析结果如图 5所示，可知14个底泥样品中古菌群落大致可分为2个大簇：位于下游的采样点黄腊坨(9#)、细河(10#)和对坨(12#)为一大簇，其余采样点为另一大簇.可见，浑河底泥中古菌的群落结构分布与细菌大不相同，并不具有明显的地域分区特征，如位于上游的采样点南杂木(1#)和位于下游的采样点于家房(11#)在空间上并不相邻，但二者却具有较高的相似度.
图5 古菌DGGE图谱聚类(UPGMA)分析
浑河底泥样品中古菌的多样性指数、种群丰度及均匀度见表 2.与细菌相同，古菌的多样性指数和种群丰度总体也呈现出先逐渐上升再逐渐下降的趋势，且分别在白塔堡河处达到其最大值2.91和2.05.说明从上游至下游底泥中古菌群落结构的变化情况与细菌一致，也是由简单变为复杂再变为简单.
3.4 细菌和古菌的种群结构与水环境因子的相关性
运用冗余梯度分析(RDA)，将细菌DGGE图谱的数字化结果和水样理化指标结合在一起分析，结果概括于表 3，排序结果如图 6a所示.可知，第一轴(λ=0.171)和第二轴(λ=0.131)揭示了50.9%的信息量，而4个轴总共揭示了78.2%的属种数据变化.第一轴与硝氮(NO3--N)和亚硝氮(NO2--N)的相关系数较高，分别为-0.6751和-0.7645，而第二轴与pH和叶绿素(Chl-a)的相关系数较高，分别为0.7494和0.6550.说明底泥中的细菌群落结构主要与水中的NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a相关.
表3 环境因子与细菌群落和古菌群落的RDA结果
图 6为基于古菌DGGE图谱的样品与理化因子的 RDA排序图，结合表 3可知，图中前4个轴揭示了74.5%的信息量，其中，第一轴(λ=0.207)和第二轴(λ=0.112)揭示了49.5%的信息量;在古菌种类与环境因子之间的相关系数中，轴1(r=0.985)和轴2(r=0.976)的相关性都很高.第一轴与氨氮(NH4+-N)和叶绿素(Chl-a)的相关系数较高，分别为0.5788和0.4893，而第二轴与总磷(TP)和硝氮(NO3--N)的相关系数较高，分别为-0.3702和-0.3321.说明底泥中古菌群落结构主要与水中的NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N相关.
图6 基于细菌(a)和古菌(b)DGGE图谱的样品与环境因子的 RDA排序图
4 结论
1)从上游至下游，浑河底泥中细菌与古菌的群落结构均由简单变为复杂，其Shannon多样性指数总体均呈现先逐渐增大再逐渐减小的趋势，变化范围分别为3.00~3.88和2.10~2.91.
2)浑河底泥中具有丰富多样的细菌种类，而古菌种类则相对较少，所有采样点底泥中细菌的Shannon多样指数和种群丰度R均大于同一地点底泥中古菌的Shannon多样指数和种群丰度R，说明细菌是浑河表层底泥中的主要存在的微生物.
3)浑河底泥样品中细菌群落结构出现了较为明显的地域分区特征，乡村段、城市段和城镇段河流的相邻采样点间的群落结构较为相似，而古菌群落结构则不具有明显的地域分区特征.
4)浑河底泥中细菌群落与上覆水中NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a有明显相关性，而古菌群落则与NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N有明显相关性.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
5 建议
RDA分析结果表明，NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TP、Chl-a和pH是影响浑河底泥中细菌与古菌群落的主要因素，其中，Chl-a含量较高亦是因N、P物质较多而引起水体富营养化的结果.因此，控制和减少水中N、P等营养物质的含量是浑河修复治理过程中的重要问题之一.可通过人工投加微生物的方法来减少水中N、P等污染物的含量.如采用固定化氮循环细菌技术，即从浑河底泥中提取天然无害的氮循环细菌，进行驯化，然后为之提供生存载体.同时，应加大污染控制力度，提高污水处理能力，各部门积极配合，全面综合治理浑河水质，才能使之得以全面改善.