1 引言
真菌是微生物群里对合成染料降解最高效的微生物.相对于细菌，真菌降解范围的广谱性及降解产物的无毒性使其逐渐引起人们的关注，但真菌本身对外界环境适应的局限性也影响了其更广泛的应用.固定化是真菌投入到实际应用的一种技术手段，可以使真菌细胞和液体培养基分离，使其免受水力剪切的破坏，并且固定化培养比游离培养能更好地抵抗外界环境的影响，如pH变化的影响或者暴露在高浓度化学品中对其造成的毒性影响.
固定化技术中，海藻酸由于无毒性且形成的凝胶对微生物的刺激性较小，成为相对比较合适的基质材料.研究人员进行了大量关于海藻酸钙包埋白腐真菌、藻类细胞的研究，但由于固定化真菌处理染料时首先是污染物在载体表面积累，然后被其内部的菌丝降解，这一过程时间较长.为缩短固定化真菌对污染物的吸附时间，提高处理效率，本研究设计在固定化载体内部加入吸附材料.
本研究选择壳聚糖铁凝胶作为改善固定化菌球性能的材料.壳聚糖铁凝胶是一种合成的新型多聚物复合吸附材料，由于其多聚物特性使其具有较低的密度，能够在海藻酸钠溶液中处于悬浮状态，并且在高速振荡下能够均匀分布在海藻酸钠溶液中，适宜用于本研究.
过去固定化菌种的选择中多以黄孢原毛平革菌为主，其在降解染料时，主要依靠分泌木质素降解酶对染料进行降解，但使用的菌种多是从国外引进，并且木质素产酶量制约了其在环境领域的大规模应用.本研究选择新疆本土采集的菌种作为固定化的菌种，经ITS测序鉴定为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，属于半知菌纲(deuteromycetes)，壳霉目，杯霉科，为目前已知的高产漆酶菌.漆酶是单电子氧化还原酶，通过生成底物自由基中间体及4个铜离子的协同作用催化不同类型底物氧化反应，可以有效地降解难降解染料.本研究首次尝试将疣孢漆斑菌固定化到海藻酸钙中，并将壳聚糖铁凝胶和疣孢漆斑菌结合起来，综合分析其对染料的处理能力及处理机制，同时对结合后漆酶的活性进行检测.
2 材料和方法
2.1 实验材料
实验选用的壳聚糖(脱乙酰度 91.04%)购自浙江金壳生化公司，氯化铁、乙醇(分析纯)、海藻酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，分析用试剂ABTs购自Aladdin公司，实验用染料为商用产品.实验中用水为去离子水.
真菌菌种I-5由浙江大学农业与生物技术学院王洪凯老师提供，由其从新疆的腐殖地皮上分离采集，4 ℃下保存在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，每3个月再次培养.
2.2 壳聚糖铁凝胶的制备
将壳聚糖粉末溶解在0.1 mol · L-1氯化铁溶液中，搅拌4 h后加入乙醇，壳聚糖铁固体析出，固体用乙醇冲洗以清洗多余FeCl3，并在80 ℃下干燥，干燥后的固体放在5%的戊二醛乙醇溶液中交联2 h，用乙醇和去离子水梯度冲洗，然后置于烘箱中80 ℃烘干，即制备成壳聚糖铁凝胶
2.3 真菌活化发酵
I-5真菌在28 ℃条件下在PDA培养基上活化培养7 d，待菌丝布满培养基后，用1 cm2打孔器在培养基上打孔，接种到PDB(Potato dextrose broth)中，置于恒温振荡培养箱中于28 ℃、150 r · min-1条件下振荡培养.
2.4 真菌种类鉴别
为了鉴别I-5真菌的种类，需提取培养在PDA 上菌丝的DNA，并进行PCR扩增、测序.PCR扩增时采用的引物为通用引物ITS1、ITS4，上游引物ITS1-F: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4-R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，PCR反应体系见表 1，反应条件为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30~40 s，55 ℃退火30~40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min.PCR扩增后在琼脂糖凝胶中进行电泳，将电泳后的凝胶置于Tanon 2500 成像系统中成像.电泳结束后的琼脂糖凝胶回收纯化后送到上海生物工程有限公司进行测序，将测序后的序列与电泳分析图进行比较确定测定结果是否准确，并在NCBI(National Center for Biotechnology information)上进行核苷酸的比对以确定该菌种的种类.
表1 PCR反应体系
2.5 固定化
固定化即将培养的I-5菌种包埋到海藻酸钠球中.将25 mL接种培养2 d的I-5菌培养基混合溶液同0.02 g · L-1的海藻酸钠溶液(50 mL)混合后分成两份，一份加入0.7 g壳聚糖铁凝胶并用涡旋振荡器混合均匀，另一份不加作为对照.混合溶液通过用1 mL注射器逐滴滴加至0.2 mol · L-1氯化钙溶液中，并低速搅拌以防止粘结.为了最小化菌丝的离散，本研究采用再包埋的方法(Daâssi et al., 2013)，将之前固定化好的小球用去离子水冲洗过后置于0.5 g · L-1 的海藻酸钠溶液中，使球中的Ca2+和海藻酸钠结合在球的表面再次形成一层海藻酸钙层，最后用0.07 g · L-1的氯化钠溶液冲洗(Enayatzamir et al., 2010).
2.6 脱色实验
2.6.1 确定球/培养基最优比例
固定化的真菌小球按照0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g · L-1的比例加入到等量相同的液体培养基中，培养1 d后，加入适量酸性红73(AR73)，配成50 mg · L-1的含染料培养基，24 h后测定染料的脱色率，确定球/培养基最优比例，反应温度为28 ℃.
2.6.2 对照试验
最优球/培养基比例下，在50 mL、50 mg · L-1 AR73染料培养基中，比较固定化壳聚糖铁菌球、固定化菌球、灭活的固定化壳聚糖铁菌球(采用2.5%的次氯酸钠灭活)24 h染料的脱色率.
2.6.3 染料初始浓度的影响
在染料浓度为50、100、150、200、250 mg · L-1的条件下测定不同时间下固定化壳聚糖铁菌球对染料的脱色率变化.
2.6.4 振荡影响研究
比较静态和150 r · min-1振荡条件下固定化壳聚糖铁菌球、固定化菌球不同时间段的染料脱色率.
2.6.5 对不同酸性染料的脱色
测定固定化壳聚糖铁菌球对酸性蓝113(AB113)、酸性蓝193(AB193)、酸性红GR(AR9)、酸性黑10B(AB1)等不同染料24 h的脱色率.
2.7 漆酶活性测定
漆酶活性测定采用分光光度法，λ=436 nm(ε436=29300 L · mol-1 · cm-1)，用ABTS作为底物，300 μL、10 mmol · L-1 ABTs溶液和2670 μL醋酸钠缓冲溶液(0.2 mol · L-1，pH=4.5)混合，30 ℃水浴下恒温10 min，加入样品30 μL，利用紫外分光光度计的Time course程序测定单位时间内的数值变化，醋酸钠缓冲溶液作空白.
2.8 固定化菌球表征
通过电子扫描显微镜研究菌球表面和横截面的形态学，菌球的扫描电镜图(SEMs)利用SU8010在3.0 kV下检测.由于样品含真菌，在检测前对样品要进行前处理.
3 结果与讨论
3.1 固定化菌球表征
实验中制备的壳聚糖铁固定化菌球表面(图 1a、1b)和横截面(图 1c、1d)的扫描电镜照片如图 1所示.由1a可以看出，菌球的表面布满了菌丝;图 1b为固定化菌球表面1000倍的放大图，可以更加细致地观察到I-5菌丝的形态为长杆型，且在部分区域可以看到分生孢子.
图1 壳聚糖铁固定化菌球表面(a，b)及横截面(c，d)扫描电镜图
图 1c显示出明显分层现象，球表面由厚厚的菌丝包裹，内部则是海藻酸钙.从内部放大图(图 1d)可以看到，在球体的内部也生长有菌丝，其被海藻酸钙紧紧包埋.由SEMs可以看出，疣孢漆斑菌在被海藻酸钙固定化后长势良好，具有较高的生长密度，便于在脱色实验中更好地发挥作用.
3.2 真菌种类鉴别
图 2的电泳分析图显示，I-5的条带在500~750 bp之间，550 bp左右，而测出来的核苷酸序列长度也在这一范围内，所测出来的核苷酸序列与电泳分 析相符.将I-5的核苷酸序列放到NCBI上进行比对，比对出这种真菌和NCBI上ID为gb|KC140223.1|的序列相似度为99%，比对结果确定I-5真菌为疣孢漆斑菌.
图2 I-5在EB着色的1.5%琼脂糖凝胶DNA量电泳图(M是Trans2K Plus DNA 标记物)
测得I-5核苷酸序列如下：
>I-5
AAACTCCCAACCCTTTGTGACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACC AGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAAT AAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGC CCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGT GGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAAGAAAT
3.3 球/培养基最优比例确定
由表 2可以看出，接种量在0.15~0.25 g · L-1时，球对染料的24 h去除率能达到90%以上，且在20%时去除率达到最大.这同对固定化白腐真菌对染料的脱色研究结果相似，球的接种量比例都在20%左右，且由于本研究中壳聚糖铁凝胶的加入，极大地改善了对染料的处理效果，研究的24 h的脱色率最高达50%左右.
表2 接种量(球/培养基)对染料去除的影响
3.4 对照实验
为了判定固定化壳聚糖铁菌球脱色染料时壳聚糖铁和I-5菌丝各自对脱色所起作用的大小，设计了对照试验.由于壳聚糖铁凝胶在高温高压下吸附性能受到影响，因此，采用0.025 g · L-1的NaClO对固定化壳聚糖铁菌球进行灭活，既不影响壳聚糖铁的性能，同时便于操作.
由图 3可以看出，与壳聚糖铁固定化菌球相比，灭活后的菌球的脱色能力明显衰退.灭活的壳聚糖铁固定化菌球在24 h时对染料的去除效果达到平衡，表明在这段时间壳聚糖铁凝胶对染料的吸附起主要作用;并且通过比较壳聚糖铁固定化菌球和灭活壳聚糖铁菌球两条曲线的差异可以得出，疣孢漆斑菌在染料脱色中起着积极的作用，真菌处理染料的机制最主要的是生物吸附和生物降解.通过比较固定化菌球和灭活菌球的曲线差异，可以判别菌种降解所起到作用的大小.固定化菌球对染料的脱色曲线呈现稳步上升趋势，说明随着时间延长，代谢产物酶的积累，菌丝的降解作用逐步增强，菌丝对染料的降解过程是一个缓慢的过程.同时，灭活的菌球对染料也有部分去除能力，证明海藻酸钙对染料也有吸附作用，关于海藻酸钙球对污染物(如染料)有去除作用也有相关的研究报道.
图3 灭活前后菌球对染料的脱色率(150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)
3.5 染料浓度的影响研究
实验研究了固定化壳聚糖铁菌球对不同最初浓度染料的脱色率差别，结果如图 4所示，不同于之前普通的固定化菌球随着染料浓度升高，脱色效果呈现差异较大的递减趋势的性质，改良后的壳聚糖铁固定化菌球对初始浓度为50~150 mg · L-1的染料去除率能达到90%以上，而在染料初始浓度大于200 mg · L-1时，其去除率也高于70%，远高于之前固定化菌球对染料脱色研究的效果.壳聚糖铁固定化菌球在48 h内对染料的去除效果能达到平衡，较之以往对真菌脱色染料的研究，改良后的菌球缩短了处理的时间，为真菌投入到处理废水实际应用增加了可能.
图4 最初染料浓度对脱色率的影响(150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)
3.6 振荡影响研究
壳聚糖铁固定化真菌和固定化真菌在静态和振荡条件下对染料的脱色能力比较如图 5所示，在静态条件下，疣孢漆斑菌的固定化菌球对染料的去除能力低于振荡条件下菌球的去除能力.振荡条件可以满足微生物对氧气的需求，增加溶液中的溶解氧含量，增强气-液之间的传质作用，加强菌丝的代谢，这可能影响菌丝的形态并且影响酶的合成率，对于染料的降解起到了积极的作用.另外，随着固定化菌球培养时间的延长，染料的去除效果有了明显的改善，固定化菌球和培养基中的染料接触的过程时间较长，培养基中的染料首先被吸附到海藻酸钙上，逐渐积累然后被降解.壳聚糖铁凝胶的加入，大大缩短了染料吸附积累到球表面的时间，便于菌丝进行降解，从而提高了染料的去除效率.
图5 振荡(150 r · min-1)和静态条件下对染料的去除比较
3.7 对不同染料的脱色研究
由于分子间的复杂结构随着有机链和相应官能团的不同而发生变化，直接影响某些吸附材料的吸附性能.同时，研究发现，真菌对不同染料的降解能力也不尽相同.所以，为了判断真菌和吸附材料结合以后对染料的去除效果，实验研究了在相同条件下，壳聚糖固定化菌球对其他酸性染料(浓度为50 mg · L-1)的脱色效果.如图 6所示，24 h后，壳聚糖铁固定化菌球对这几种酸性染料的去除率均能达到90%以上，表明该材料对酸性染料的去除具有广谱性.真菌和吸附材料的结合，既可以通过吸附材料的吸附降低染料对真菌产生的毒性影响，也可以通过真菌的降解作用扩大吸附材料的吸附阈值，两者相互协同作用.
图6 壳聚糖铁固定化菌球对不同染料的脱色率
3.8 漆酶酶活测定
漆酶为疣孢漆斑菌在生长过程中所产生的次级代谢产物，具有高氧化能力.漆酶被应用在很多方面，最重要的就是脱色难降解的染料(Mishra et al., 2011)，这是因为漆酶含有4个铜原子提供了不同键位使其在催化机制中起到重要作用.漆酶的存在可以通过测定漆酶的活性来判断，为了确定改良后的固定化菌球在处理染料时仍能产生漆酶，对投加菌球的染料取样测定酶活性.结果表明，24 h时酶活性为(48.63±4.26)U · mL-1，48 h时为(81.40±3.18)U · mL-1.实验数据表明，壳聚糖铁固定化菌球投加到染料中后，菌丝具有较高活性.球中疣孢漆斑菌菌丝迅速增殖并覆盖到菌球表面后，次级代谢产物逐渐积累，使测定的漆酶活性值呈现上升趋势，有利于染料的降解.具体参见 污水处理技术资料或污水技术资料更多相关技术文档。
4 结论
壳聚糖铁固定化菌球是对传统固定化菌球的改良，也是对疣孢漆斑菌的一种新型应用.壳聚糖铁凝胶的加入缩短了水体中污染物集聚到机体表面的时间，提高了染料去除的效率;壳聚糖铁的吸附作用可以降低高浓度染料对菌丝所产生的毒性，扩大菌球处理染料的阈值，使其对200~250 mg · L-1的染料仍能保持较高的去除率;对于固定化疣孢漆斑菌来说，动态培养更有利于其对染料的处理.壳聚糖铁固定化菌球投加到染料后，菌丝具有较高活性，漆酶产量高，48 h达到(81.40±3.18)U · mL-1.壳聚糖铁凝胶和疣孢漆斑菌的结合，相互协同，弥补了各自在处理某种染料的局限性，使其处理范围更加广泛，对于今后投入实际应用具有很大的潜力.