一株鱼粉加工硫化氢恶臭气体脱除菌株的分离与鉴定

2017-03-15 08:56:00 2

  鱼粉是水产动物以及畜禽动物养殖饲料中无法替代的优质动物蛋白源[1]。然而,因加工原料新鲜度不断下降、腐败等原因,鱼粉加工在高温蒸煮和干燥工序过程中会释放出大量的恶臭气体,潘光等[2]已经分析测定出鱼粉加工恶臭气体污染成分主要有两类,其中含硫氨基酸产生的终产物H2S是鱼粉加工恶臭气体的主要成分。H2S气体是恶臭成分中最为常见而且影响广泛的气体,会引起设备和管道腐蚀,导致严重的空气污染,在空气中容易被氧化成SO2,可对生态环境产生酸雨效应和毒副作用,H2S气体还对人体有毒,低浓度中毒对人体眼睛和呼吸系统具有强烈的刺激和腐蚀作用,重度中毒造成中枢神经系统、心脏、肺细胞损害,出现肺水肿,呼吸、心跳骤停,发生闪电型死亡。

  对于恶臭气体的治理主要采用遮蔽法、物理化学法、生物法等,遮蔽法没有完全去除恶臭物质,极易造成二次污染,治理成本也比较高;物理化学法仅能处理成分单一的尾气,一般设备比复杂,能耗高,处理后仍然不能达到排放标准。生物脱臭技术[3-15]具有脱臭效率高、没有二次污染、设备简单、运转成本较低的优点。目前为止,国内对鱼粉加工中有关含硫臭气脱除微生物筛选与鉴定的研究还未见报道。本研究旨在筛选获得高效脱除硫化氢恶臭气体的菌株,为生物法脱除鱼粉加工恶臭气体的应用提供一定的理论基础。

  1 材料和方法

  1.1 分离源

  宁波市象山某鱼粉加工厂的污水沉淀池中的污泥。

  1.2 主要培养基

  富集培养基:营养肉汤培养基(筛选细菌):蛋白胨10.0,牛肉浸出粉3.0g,氯化钠5.0g加热溶于1000mL蒸馏水中,121℃ 灭菌15min,pH 值7.2~7.4;察氏培养基(筛选真菌):硝酸钠3.0g,磷酸氢二钾1.0g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,硫酸亚铁0.01g,蔗糖30.0g加热溶解于1000mL蒸馏水中,分装115~116℃高压灭菌30min;自养硫细菌培养基[A][16](筛选自硫菌):Na2HPO4 3.03g,KH2PO42.0g,Na2CO31g,MgCl0.1g,FeCl30.033g,CaCl20.03g,MnCl20.032g,Na2S2O315.7g,蒸馏水1L,其中Na2S2O3 配成溶液过滤除菌,灭菌后加入;自养硫细菌培养基[B][16](筛选自硫菌):Na2S2O35g,K2HPO40.4g,KNO30.4g,NaHCO30.2g,MgSO4 0.12g,NH4Cl0.1g,FeSO4 0.02g,蒸馏水1L,其中Na2S2O3 配成溶液过滤除菌,灭菌后加入。

  分离培养基:各富集培养基加2%琼脂。

  1.3 主要试剂

  API50CHB试剂条:购自上海梅里埃生物工程有限公司。

  AxpPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒:Axygen,AP-MN-BT-GDNA-50;DNA 凝胶回收试剂盒;TaqDNA聚合酶;DNAmarker均购自上海桑尼生物工程有限公司。

  1.4 主要仪器

  硫化氢分析仪:TY-400-H2S(北京泰亚赛福科技发展有限责任公司);光学显微镜:BX51型,(O-lympus公司);扫描电镜:SU-70型(HITACHI公司)。

  2 脱硫微生物的筛选

  2.1 高效除硫菌的筛选

  2.1.1 脱硫微生物的富集筛选

  称取10g活性污泥样品,分别接种于装有100mL灭菌后的营养肉汤培养基、察氏液体培养基、自养脱硫细菌培养基A、自养脱硫细菌培养基B的250mL三角瓶中,充分摇匀,30℃,150r/min的条件下摇瓶培养15d,每天往各组培养基中添加Na2S·9H2O(相当于200mg/L的H2S),以淘汰不能利用S2-的微生物。每3d进行接种传代,即每次培养3d后,取10mL原培养液接种到新配置灭菌后的100mL各组培养基中。经15d富集培养后,将各组培养液稀释涂布到对应的平板,30℃倒置培养,平板长出单菌落后挑选典型单菌落反复进行平板划线,直至得到单一菌落,接种到对应的斜面上,4℃冷藏备用。

  2.1.2 高效脱硫微生物的筛选

  初筛:取纯化菌株接种于对应类型的培养基中,30℃、150r/min振荡培养24h。取培养菌液按10%接种量加入到含Na2S·9H2O(相当于200mg/L的H2S)的对应培养基中,摇匀,用双层保鲜膜封口,30℃静置培养5d,打开封口,用感官法初步判定菌株除臭效果。

  复筛:取除臭能力明显的菌株培养液,按10%接种量加入到含Na2S·9H2O(相当于200mg/L的H2S)对应培养基中,30℃静置培养5d后,用便携式H2S检测仪测定H2S浓度,每组做8个重复,同时设空白对照组。选择脱硫率最高的目的菌株,接种于对应斜面上,4℃冰箱保存。脱硫率为空白组与实验组的H2S浓度差除以空白组H2S浓度。

  2.2 高效除硫菌的鉴定

  2.2.1 形态学研究

  参考伯杰氏手册,采用普通光学显微镜、扫描电镜(SEM)观察菌株形态特征,并确定菌体大小。

  2.2.2 生理生化特征分析

  基础生化实验:运动性(半固体穿刺法);硝酸盐还原;产H2S;VP反应;甲基红实验;接触酶实验;氧化酶试验;吲哚反应。

  碳源的利用实验:API50CHB 试剂条,API50CHB试剂条是一种用于研究芽孢杆菌的49种糖发酵作用的快速测定试剂条。具体参见污水技术资料更多相关技术文档。

  2.2.3 分子生物学鉴定

  16SrDNA扩增引物:采用通用引物,27F5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R 5′-CTACG-GCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 扩增反应体系(50μL):基因组DNA1.0μL,10×Buffer5.0μL,Taq聚合酶1.0μL,dNTP1.0μL,27F引物1.5μL,1492R引物1.5μL,ddH2O39.0μL。反应参数如下:95℃预变性5min;95℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s;72℃终延伸7min;循环数35次。反应完成后,取30μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收后进行测序。测序结果与NCBIGenBank中的已知序列进行同源性比较后,判断菌株种类,将其划分到属或种。

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